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疟疾传播阻断疫苗免疫效应机制的实验研究

作　者: 李冬梅
导　师: 曹雅明
学　校: 中国医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 疟原虫传播阻断疫苗免疫机理免疫效应 Pvs25 Pvs28 Pys25
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

以昆虫蚊为传播媒介的疟疾是一种严重危害人类健康的原虫感染性疾病。WHO的报告显示，全世界近1／3的人口生活在疟疾风险区，每年约200万人因其死亡。虽然抗疟治疗对降低疟疾的死亡率和抑制其传播取得了显著成效，但由于耐药性虫株和抗杀虫剂性蚊株的普遍出现，单纯的抗疟治疗已不能有效地遏制疟疾的流行。因此，开发有效的疟疾疫苗是当今疟疾防治亟待解决的课题。疟疾疫苗主要包括抗感染疫苗、抗发病疫苗和传播阻断疫苗。近年来，国内外学者在致力于疟疾感染阻断疫苗和发病阻断疫苗研发的同时，也愈发关注的传播阻断疫苗研制。传播阻断疫苗，是以蚊阶段原虫特异表达的表面蛋白作为抗原免疫宿主，其产生的抗体可同蚊胃内原虫发育时表达的表面蛋白发生特异性结合，并以此抑制原虫在蚊体内的进一步发育，从而阻断疟疾的传播。与其他两类疫苗相比，其优点为靶虫体—配子体数目明显少于红内期原虫数目；作为疫苗开发研究障碍的抗原变异较为少见；通过与药物或其它疟疾疫苗的联合应用可防止耐药性原虫的扩散。由于传播阻断疫苗候选抗原仅表达于蚊阶段虫体，人体免疫压力不会对其产生影响，故抗原变异少见；由于该候选疫苗在宿主体内基本不表达，人体自然感染不能产生传播阻断抗体，所以研制开发并应用接种于宿主意义重大。而更重要的是，从群体角度出发，个体接种疫苗后，受益的将是整个流行区内的人群。数种疟原虫的克隆结果显示，传播阻断蛋白可被分成2个亚家族，即P25和P21／P28。有文献报道：Pbs21(P．berghei)在配子体发生后2h即有表达，并在合子和动合子表面持续存在；Pbs21基因敲出后，其动合子向囊合子的发育明显受阻。蚊吸血或体外培养等实验结果也表明，抗Pfs28(P．falciparum)、抗Pgs28(P．gallinaceum)、抗Pys21(P．yoelii)和抗Pbs21的单克隆抗体或免疫血清均具有明显传播阻断效应，其作用机制可能是IgG阻断动合子对蚊胃上皮细胞的侵入。Pbs21可同蚊胃粘膜的层粘连蛋白发生特异性结合，使用抗Pbs21抗体封闭Pbs21后，即能抑制动合子对蚊胃基底膜上粘连蛋白的结合，进而阻断囊合子的形成。因此，抗体与P25和P21／28发生特异性结合进而妨碍抗原的功能可能是传播阻断抗体的主要作用机制。酵母菌表达的Pvs25以及Pvs28可诱导机体产生高滴度抗体且具有理想的传播阻断效应已被实验所证实，但就其免疫原性的系统研究目前尚未见报道，而疫苗效应的原理恰恰在于它可在接种疫苗的个体中诱生抗原特异性T细胞和B细胞。确定疫苗的免疫原性是评价疫苗的有效性的前提。真核细胞表达的传播阻断候选蛋白在空间构象上与其天然结构基本相似，其诱导的传播阻断效应也明显优于原核细胞表达的蛋白分子。间日疟原虫(P．vivax)是我国流行最为严重的虫种，为此，我们以酵母菌(S．cerevisiae)表达的传播阻断疫苗候选蛋白Pvs25和Pvs28免疫小鼠，并对小鼠免疫后的应答特点进行了全面系统的研究，以期明确该疫苗的免疫活性。由于啮齿类疟原虫与人类疟原虫具有相似的生物学性状，所以我们同时也用该酵母菌表达的约氏疟原虫(P．yoelii)动合子表面蛋白Pys25对小鼠进行免疫，通过对其免疫活性、免疫机制以及免疫血清传播阻断效应的观察，进一步证明了传播阻断疫苗的效应分子和作用机制。方法一、采用ELISA法检测Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫前后DBA／2小鼠血清中特异性IgG的水平尾尖采集初次免疫前和免疫后不同时间小鼠血液，分离血清。分别以溶于碳酸盐缓冲液的Pvs25重组蛋白(200ng／孔)，Pvs28重组蛋白(100ng／孔)包被96孔酶标板，4℃过夜；用含1％BSA的PBS封闭1h，以7BS缓冲液1∶200倍稀释免疫后不同时间的小鼠血清，每孔加100μl，室温孵育2h，加1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG孵育1h，加底物溶液。酶标仪检测490nm处OD值。二、采用ELISA法检测Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA／2小鼠前后血清中特异性IgG亚类的水平将1∶200倍稀释后不同时间段的特异性血清加入预包被好的96孔培养板中，100μl／孔，室温孵育2h，分别加入浓度为500ng／ml、250ng／ml生物素标记的大鼠抗小鼠IgG1及IgG2a检测抗体，100μl／孔，37℃孵育1h；加入亲和素37℃孵育1h，加底物，避光30min后终止反应，酶标仪检测450nm处OD值。三、采用双抗体夹心ELISA法检测Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA／2小鼠前后脾细胞培养上清中的细胞因子分别于免疫前及初次免疫后第14d、28d、42d、56d、70d、84d、98d和112d，常规无菌取小鼠的脾脏，制备浓度为1×10~7／ml脾细胞悬液，于24孔培养板中培养48h后，收集培养上清，用双抗体夹心ELISA试剂盒(R&D公司)分别检测IFN-γ、IL-4和IL-10产生水平。酶标仪测定450nm处的OD值。应用SoftMax Pro 4．3．1 LS软件分析，绘制标准品标准曲线，计算细胞因子含量(pg／ml)。四、ELISPOT检测Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA／2小鼠后脾脏IFN-γ~+和IL-4~+细胞数量分别于初次免疫后70d和98d，无菌取小鼠的脾脏，分离小鼠脾脏淋巴细胞，以无血清培养基制备脾淋巴细胞悬液，采用ELISPOT试剂盒对小鼠脾脏IFN-γ~+和IL-4~+细胞数量进行检测。主要步骤如下：以IFN-γ以及IL-4包被抗体各50μl分别包被70％乙醇予湿后的96孔PVDF膜平板，4℃过夜；加入封闭液37℃封闭1h后，每孔加入脾细胞4×10~5个，并分别加入Pvs28或Pvs25重组蛋白，置5％C02的培养箱中共同孵育24h后弃去细胞，加入生物素标记的IFN-γ或IL-4检测抗体，37℃孵育1h，加入亲和素，37℃孵育1h，显色液100μl／孔，显色30min，待显示斑点后，用去离子水洗板终止反应，ELISPOT自动分析仪读板，计数IFN-γ~+和IL-4~+L细胞SFC数量(斑点形成数／百万个细胞)。五、采用ELISA法检测Pys25重组蛋白免疫DBA／2小鼠前后血清中特异性IgG的水平尾尖采集初次免疫前和免疫后不同时间小鼠血液，分离血清。以溶于碳酸盐缓冲液的Pys25重组蛋白200ng／孔包被96孔酶标板，每孔100μl，4℃过夜；用含1％BSA的PBS封闭1h，以TBS缓冲液1∶200倍稀释免疫后不同时间的小鼠血清，每孔加100μl，室温孵育2h，加1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG孵育1h，加底物溶液。酶标仪测490nm处OD值。六、采用双抗体夹心ELISA法检测Pys25重组蛋白免疫DBA／2小鼠前后脾细胞培养上清中的细胞因子无菌取出于免疫前、初次免疫后第2W和加强免疫后第2W的小鼠脾脏，用含10％FCS的RPMI 1640培养液常规制备脾细胞悬液，调脾细胞终浓度至1×10~7／ml。于24孔培养板上加入脾细胞悬液，500μl／孔，培养48h，收集上清。用双抗体夹心ELISA试剂盒分别检测IFN-γ和IL-4产生水平。酶标仪测其450nm处OD值，并以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，计算上清中IFN-γ和IL-4含量。七、ELISPOT检测Pys25重组蛋白免疫DBA／2小鼠后脾脏IFN-γ~+和IL-4~+细胞数量用淋巴细胞分离液分离加强免疫后第2W小鼠脾淋巴细胞，以培养液调淋巴细胞终浓度至4×10~6／ml。用IFN-γ以及IL-4包被抗体分别包被96孔PVDF膜板，4℃过夜。以含BSA的PBS封闭1h，加淋巴细胞，4×10~5个／孔，每个样本设4个复孔。37℃孵育24h。加生物素标记的IFN-γ或IL-4检测抗体，孵育1h，加亲和素后再孵育1h。加显色液显色30min。ELISPOT自动分析仪读板，计数IFN-γ~+和IL-4~+细胞数量八、动合子培养和传播阻断效应观察心脏采集P．yoelii17XL(1x10~+ PRBC)感染的第3d小鼠血液(肝素抗凝)，分装于1.5ml离心管中，200μl／管，离心，去上清。加入含不同浓度免疫血清的动合子培养液，200μl／管。24℃培养工6h后，取3μl悬液滴于荧光载片上，冷丙酮固定。用含5％脱脂奶粉的PBS 37℃封闭30min。加酶标羊抗鼠IgG，孵育30min，荧光显微镜观察计数合子和动合子的形成数量。同时设单纯佐剂免疫的小鼠血清为对照。结果一、Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA／2小鼠前后血清中特异性IgG的水平的变化于初次免疫后第28d，重组蛋白免疫组的IgG水平开始上升。至初次免疫后第112d仍维持于高水平，与免疫前以及佐剂对照组相比差异显著；而对照组的抗体水平在免疫前后则无明显变化。二、Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA／2小鼠前后血清中特异性IgG亚类水平的变化重组蛋白组在初次免疫后第28d，小鼠血清中特异性IgG1以及IgG2a均出现有意义的升高，此后IgG1持续维持在一个较高的水平，至初次免疫后第112d仍无下降的趋势；而IgG2a则于初次免疫后第42d出现下降，且此后进一步下降；而对照组的抗体亚类水平在免疫前后则无明显变化。三、Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA／2小鼠前后脾细胞培养上清中细胞因子的变化1、脾细胞培养上清中IPN-γ水平于初次免疫后第14d，小鼠的IFN-γ水平与免疫前相比显著升高，但此后明显下降，并于第42d降至免疫前的水平。在第14d佐剂注射组IFN-γ水平也较免疫前出现了一定的升高，但其升高水平显著低于重组蛋白免疫组。2、脾细胞培养上清中IL-4和IL-10水平于初次免疫后第28d，重组蛋白免疫组IL-4水平均出现有意义的升高，于第56d达到峰值水平后开始下降，但在112d仍高于免疫前水平。IL-10水平亦于初次免疫后第28d出现有意义的升高，于第42d达到高峰后出现下降，但在112d也仍高于免疫前水平。佐剂组的IL-4、IL-10水平较免疫前无显著变化。四、ELISPOT检测Pvs25，Pvs28重组蛋白免疫DBA／2小鼠后脾脏IFN-γ~+和IL-4~+细胞数量疫苗免疫组小鼠的IFN-γ~+细胞数量较对照组无明显差异。而IL-4~+细胞数量却显著增加，两个时间点的IFN-γ~+以及IL-4~+细胞数分别与各自组比较无明显差异。佐剂组的IL-4~+水平较免疫前无显著变化。五、Pys25重组蛋白免疫DBA／2小鼠前后血清中特异性IgG的水平变化初次免疫后2W，小鼠血清中IgG出现升高，并于加强免疫后2～3W达到峰值水平。此后开始缓慢下降，但其在20w的水平也明显高于加强免疫前的水平。六、Pys25重组蛋白免疫DBA／2小鼠后不同时间检测点上的细胞因子水平与免疫前相比，初次免疫后2W，小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4均出现了有意义的升高，但前者的升高水平更为显著；再次免疫后仅见IL-4出现了进一步的升高，而IFN-γ已降至初次免疫前的水平。七、Pys25重组蛋白加强免疫DBA／2小鼠后脾细胞中IFN-γ~+和IL-4~+细胞数量与免疫前相比，加强免疫后2W，小鼠脾细胞中IL-4~+细胞的数量出现了显著的升高，但IFN-γ~+细胞的数量未出现有意义的变化。八、动合子培养和传播阻断效应与对照组相比，Pys25重组蛋白加强免疫后2w的抗血清对合子和动合子的形成具有明显的抑制效应，该效应呈现明显的剂量依赖性，其中4倍稀释的抗血清几乎完全阻断了虫体的发育。并且，免疫20W的抗血清对虫体的发育也仍具有明显的抑制效应。结论1、Pvs25、Pvs28重组蛋白具有较好的免疫活性，免疫DBA／2小鼠后可产生高水平的抗体；2、Pvs25、Pvs28免疫DBAl2小鼠后产生以的抗体亚类以IgG1为主；3、Pvs25、Pvs28重组蛋白可诱导DBA／2小鼠产生以Th2反应为主的免疫应答；4、Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA／2后可诱导较强的特异性免疫应答，并具有显著的免疫记忆性；5、Pys25重组蛋白免疫DBA／2小鼠后诱导小鼠产生的免疫应答类型以Th2反应为主；6、Pys25重组蛋白具有良好的免疫原性，其免疫血清可显著抑制有性阶段原虫的进一步发育。

全文目录

一、摘要  6-20
  中文论著摘要  6-13
  英文论著摘要  13-20
二、英文缩略语  20-21
三、论文  21-43
  论文一间日疟传播阻断疫苗 Pvs25和Pvs28重组蛋白免疫活性的实验观察  21-27
    前言  21-22
    实验材料与方法  22-23
    实验结果  23-25
    讨论  25-26
    结论  26-27
  论文二间日疟原虫重组蛋白Pvs25和Pvs28免疫小鼠应答机制的实验研究  27-35
    前言  27
    实验材料与方法  27-30
    实验结果  30-33
    讨论  33-34
    结论  34-35
  论文三约氏疟原虫重组蛋白Pys25免疫活性以及免疫血清传播阻断效应的实验观察  35-43
    前言  35-36
    实验材料与方法  36-38
    实验结果  38-41
    讨论  41-42
    结论  42-43
四、本研究创新性的自我评价  43-44
五、参考文献  44-49
六、附录  49-59
  综述  49-57
  在学期间科研成绩  57-58
  致谢  58-59
  个人简介  59

疟疾传播阻断疫苗免疫效应机制的实验研究

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