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多角体融合的家蚕表皮膜蛋白N141的高效表达与纯化

作　者: 周汇敏
导　师: 张耀洲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕 膜蛋白 多角体蛋白 大肠杆菌表达系统 杆状病毒表达系统
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


膜蛋白是生物膜功能的主要承担者,其结构、功能的研究对了解认识膜蛋白起着至关重要的作用,而研究的前提是纯化膜蛋白。由于膜蛋白一般整合在生物膜上,同时表达量又十分有限,往往难以分离纯化。本论文研究将多角体蛋白基因与膜蛋白基因分别在大肠杆菌和家蚕细胞中实现高效融合表达并开展纯化研究。从本实验室构建的家蚕跨膜蛋白序列cDNA文库中筛选获得一条cDNA序列,将其命名为N141。经生物信息学分析发现该基因编码的蛋白含有保守结构域chitinbind4,该序列含有一435 bp的开放阅读框,预测编码144个氨基酸残基,编码蛋白质分子量大小为16.9 kDa,有一个跨膜区。根据其ORF框设计上下游引物,PCR扩增目的基因并克隆到载体pBacPAK8-Polh中,构建重组质粒pBacPAK8-Polh-N141。用BamH I和EcoRⅠ双酶切上述重组质粒,将Polh-N141基因片段克隆到载体pET-28a的相应酶切位点,成功构建重组质粒pET-28a-Polh-N141。用IPTG诱导含重组质粒的工程菌表达,裂解菌液经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定发现融合蛋白高效表达且主要以包涵体的形式存在于沉淀中。利用多角体蛋白基因强启动子特性,使得融合蛋白Polh-N141高效表达。利用多角体蛋白的溶解度特性,通过梯度pH洗涤法即梯度pH值的Tris·Cl缓冲液洗涤沉淀来纯化融合蛋白。纯化的融合蛋白经Western blotting和肽指纹图谱证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白。将纯化的融合蛋白用TEV酶切去除多角体,以纯化膜蛋白N141。利用多角体蛋白的相关性质,使膜蛋白大量表达且便捷纯化。同时,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将Polh-N141基因片段克隆到载体pFastBac HTb,构建重组质粒pFastBac-Polh-N141并转化DH10Bac E.coli,与家蚕杆状病毒基因组Bacmid发生转座,得到重组杆状病毒基因组并转染家蚕细胞BmN以获取重组杆状病毒vPolh-N141,经重组杆状病毒转染的家蚕细胞发病后,Western blotting鉴定已表达融合蛋白。本研究尝试高效表达并纯化膜蛋白,为对其进行结构功能研究奠定基础。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-9
缩略语  9-13
第一章 文献综述  13-17
  1 膜蛋白的研究意义  13
  2 膜蛋白的研究现状  13-14
  3 表皮蛋白的研究概述  14-15
  4 以核型多角体病毒（NPV）为载体的昆虫表达系统  15-16
    4.1 原理  15
    4.2 转移载体质粒的构建——利用多角体蛋白基因启动子  15-16
  5 研究展望  16-17
第二章 实验设计  17-20
  1 实验目的和意义  17
  2 研究内容  17-18
  3 实验流程图  18-20
第三章 生物信息学分析  20-25
  1 生物信息学工具  20
  2 生物信息学分析结果  20-24
    2.1 基因的基本信息  20-21
    2.2 保守结构域  21
    2.3 疏水性分析  21-22
    2.4 跨膜分析  22
    2.5 信号肽分析  22-23
    2.6 蛋白质的同源性比较  23
    2.7 蛋白质的定位预测  23-24
  3 讨论  24-25
第四章 家蚕表皮膜蛋白基因N141 的克隆  25-37
  1 材料与试剂  25-27
    1.1 材料  25
    1.2 试剂  25
    1.3 主要试剂的配置  25-27
  2 实验方法  27-33
    2.1 pBacPAK8-Polh-N141 重组质粒构建策略  27-31
      2.1.1 PCR 扩增目的片段  28-29
      2.1.2 PCR 产物试剂盒回收  29
      2.1.3 PCR 产物与载体pBacPAK8-Polh 双酶切  29
      2.1.4 胶回收酶切产物  29-30
      2.1.5 连接反应  30
      2.1.6 E.coli TG1 感受态细胞的制备  30
      2.1.7 连接产物的转化  30-31
      2.1.8 挑斑及质粒抽提  31
      2.1.9 重组克隆的筛选与鉴定  31
    2.2 pET-28a-Polh-N141 重组质粒构建策略  31-33
      2.2.1 双酶切重组质粒pBacPAK8-Polh-N141 及载体pET-28a  32
      2.2.2 连接、转化  32
      2.2.3 挑斑、质粒抽提及鉴定  32-33
  3 结果  33-35
    3.1 PCR 扩增目的片段  33
    3.2 pBacPAK8-Polh-N141 重组质粒的鉴定  33-34
    3.3 pET-28a-Polh-N141 重组质粒的鉴定  34-35
    3.4 序列测定  35
  4 讨论  35-37
第五章 融合蛋白的原核表达及纯化  37-50
  1 材料与试剂  37-40
    1.1 材料  37
    1.2 试剂  37
    1.3 主要试剂的配制  37-40
  2 实验方法  40-43
    2.1 融合蛋白Polh-N141 的表达  40-41
      2.1.1 E.coli BL21 感受态细胞的制备  40
      2.1.2 重组质粒转化大肠杆菌BL21 表达菌株及鉴定  40
      2.1.3 重组质粒在大肠杆菌中的表达  40
      2.1.4 SDS-PAGE 电泳分析  40-41
    2.2 融合蛋白的纯化  41-43
      2.2.1 梯度pH 值的Tris·Cl 缓冲液洗涤纯化融合蛋白  41
      2.2.2 包涵体的溶解及镍柱纯化融合蛋白  41-42
      2.2.3 Millipore 除盐浓缩  42
      2.2.4 Bradford 法检测蛋白浓度  42-43
    2.3 融合蛋白的酶切  43
  3 结果  43-48
    3.1 融合蛋白的诱导表达  43-44
    3.2 梯度pH 值的Tris·Cl 缓冲液洗涤纯化融合蛋白  44-46
    3.3 镍柱纯化融合蛋白  46-47
    3.4 融合蛋白的酶切结果  47-48
  4 讨论  48-50
第六章 融合蛋白的真核表达  50-64
  1 Bac-to-Bac 系统  50-51
  2 Bac-to-Bac 系统重组外源基因表达的一般实验流程  51-52
  3 材料及试剂  52-54
    3.1 材料  52
    3.2 试剂  52-53
    3.3 主要试剂的配置  53-54
  4 实验方法  54-60
    4.1 pFastBac-Polh-N141 重组质粒构建策略  54-55
      4.1.1 双酶切重组质粒pBacPAK8-Polh-N141 及载体pFastBac HTb  54
      4.1.2 连接、转化  54-55
      4.1.3 挑斑、质粒抽提及鉴定  55
    4.2 Bacmid 重组质粒构建策略  55-58
      4.2.1 DH10Bac E.coli 感受态细胞的制备  55-56
      4.2.2 重组质粒 pFastBac-Polh-N141 转化 DH10Bac E.coli 感受态细胞  56
      4.2.3 挑斑及抽提Bacmid 重组质粒  56-57
      4.2.4 Bacmid 重组质粒的PCR 鉴定  57-58
    4.3 Bacmid 重组质粒转染家蚕细胞BmN  58-59
    4.4 发病细胞中融合蛋白表达的鉴定  59-60
      4.4.1 SDS-PAGE 鉴定  59
      4.4.2 Western blotting 鉴定  59-60
  5 结果  60-63
    5.1 pFastBac-Polh-N141 重组质粒的鉴定  60-61
    5.2 Bacmid 重组质粒的PCR 鉴定  61
    5.3 发病细胞病毒基因组的PCR 鉴定  61-62
    5.4 发病细胞中融合蛋白表达的SDS-PAGE 鉴定  62
    5.5 发病细胞中融合蛋白表达的Western blotting 鉴定  62-63
  6 讨论  63-64
结论  64-65
参考文献  65-68
致谢  68

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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