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具EcobNPV解旋酶基因的重组BmNPV的构建及BmCPV基因组片段2的序列分析

作　者: 刘卫星
导　师: 贡成良
学　校: 苏州大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 杆状病毒 helicase Bac-to-Bac RNA依赖的RNA聚合酶
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 19次
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内容摘要


本研究中,我们通过PCR,获得了茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nuclear polyhedrosis virus, EcobNPV) 73.7-78.9kb区域的全长序列,分析结果显示,该区域编码有该病毒的odv-e25、odv-e28和P143。通过对P143的基序分析发现,该蛋白具有典型的helicase解螺旋结构域,基于P143氨基酸序列的系统进化分析表明,EcobNPV属于核型多角体病毒属GROUPⅡ,并且昆虫杆状病毒的进化与宿主是相关联的。我们通过RT-PCR和分段克隆,获得了家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori Cytoplasmic polyhedrosis virus)苏州株(BmCPV-suzhou)的S2全长序列。分析显示,BmCPV-suzhou S2片段的全长为3854bp(GenBank登录号:GQ924586),含有一个3678bp的编码RNA Dependent RNA Polymerase(RDRP)基因的开放阅读框,并分别在5’和3’末端发现了保守序列AGUAA和GUUAGCC。基于RDRP氨基酸序列的系统进化分析表明,BmCPV的不同株系与LdCPV1、DpCPV1聚为一类。EcobNPV是茶尺蠖的病原性天敌,可以作为生物杀虫剂来防治茶尺蠖。利用Bac-to-Bac系统,首先构建了包含有BmNPV的多角体基因表达盒和EcobNPV的helicase表达盒的重组转座载体pFastBacTMDual-polh-helicase,并获得了重组病毒BmBacmid-polh-helicase,分子生物学鉴定和感染实验结果显示,该重组病毒具EcobNPV helicase表达盒,并能在细胞核中形成多角体,证明具有双套helicase表达盒的重组病毒能正常复制。

全文目录


中文摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章 文献综述  10-31
  1 杆状病毒概况  10-11
    1.1 杆状病毒分类  10-11
    1.2 杆状病毒发育循环  11
  2 杆状病毒表达载体系统  11-16
    2.1 杆状病毒表达载体系统的优越性  12
    2.2 杆状病毒表达载体系统的构建策略  12-15
    2.3 杆状病毒表达系统的应用  15-16
  3 杆状病毒作为昆虫生物杀虫剂  16-23
    3.1 昆虫杆状病毒在害虫防治中的应用  17-18
    3.2 重组杆状病毒杀虫剂的研究  18-22
    3.3 茶尺蠖核型多角体病毒对茶尺蠖的防治  22-23
  参考文献  23-31
第二章 实验方案设计  31-33
  1 研究目的与意义  31
  2 研究内容  31-32
  3 实验流程  32-33
第三章 材料与方法  33-41
  1 实验材料  33-36
    1.1 生物材料  33
    1.2 工具酶及Kit  33
    1.3 主要实验试剂与配制  33-36
  2 实验常用仪器设备  36-37
  3 常用方法  37-40
    3.1 连接反应  37
    3.2 感受态细胞的制备  37
    3.3 重组DNA 的转化  37-38
    3.4 SDS 碱裂解法制备质粒DNA  38
    3.5 酶切反应  38-39
    3.6 琼脂糖凝胶电泳  39
    3.7 细胞的培养和保存  39
    3.8 细胞转染  39-40
  参考文献  40-41
第四章 EcobNPV helicase 基因区域的片段克隆与序列分析  41-58
  摘要  41-42
  1 材料和方法  42-44
    1.1 材料  42
    1.2 方法  42-44
  2 结果  44-50
    2.1 EcobNPV helicase 区域片段的克隆与鉴定  44
    2.2 EcobNPV 73.7-78.9kb 区域的序列测定  44-45
    2.3 EcobNPV helicase 序列分析  45-46
    2.4 helicase 相似性分析  46-47
    2.5 EcobNPV 的helicase 结构域分析  47-50
    2.6 Baculoviridae 的helicase 基因的分子进化分析  50
  3 讨论  50-55
  参考文献  55-58
第五章 具有EcobNPV helicase 的重组病毒的构建  58-71
  摘要  58-59
  1 实验材料与方法  59-63
    1.1 材料  59-60
    1.2 方法  60-63
  2 结果  63-66
    2.1 pFastBac~(TM)Dual-polh-helicase 转移载体的构建  63
    2.2 pFastBac~(TM)Dual-polh-helicase 转移载体鉴定  63-64
    2.3 重组BmBacmid-polh-helicase 的产生及鉴定  64-65
    2.4 重组BmBacmid-polh-helicase DNA 转染细胞及对细胞的感染  65-66
    2.5 重组病毒在蚕蛹中感染的症状  66
  3 讨论  66-67
  参考文献  67-71
第六章 家蚕质型多角体病毒(苏州株)基因组片段2 的克隆与分析  71-83
  摘要  71-72
  1 材料和方法  72-73
    1.1 材料  72
    1.2 方法  72-73
  2 结果  73-76
    2.1 BmCPV-suzhou S2 cDNA 的克隆与序列测定  73-74
    2.2 BmCPV-suzhou S2 序列分析  74-75
    2.3 BmCPV-suzhou 的RDRP 结构域分析  75-76
    2.4 BmCPV-suzhou 的RDRP 基因的分子进化分析  76
  3 讨论  76-80
  参考文献  80-83
攻读硕士学位期间发表的学术论文  83-84
致谢  84-85

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用
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