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小反刍兽疫病毒H蛋白在家蚕杆状病毒表面的展示及其免疫原性研究

作　者: 黄春美
导　师: 张耀洲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: PPRV H 家蚕杆状病毒表面展示技术重组杆状病毒BmNPV-SHT 免疫原性检测
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR),是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种接触性、急性、烈性A类传染病,主要感染小反刍动物,目前主要通过疫苗来预防该病的发生。H糖蛋白是PPRV H基因编码的糖蛋白,预测分子量为70 kD。该蛋白是小反刍兽疫病毒的主要抗原,能够诱导机体产生保护性的中和抗体。杆状病毒表面展示系统是近几年发展起来的一种新的真核展示系统,通过在病毒衣壳蛋白GP64插入外源肽、二者融合表达或与特异性的锚定部位结合,在病毒表面进行融合表达而筛选出目的活性肽或蛋白。利用该系统可将表面表达有抗原蛋白的整个重组病毒作为免疫原或者疫苗接种动物进行免疫保护,与传统的疫苗制备方法相比免去了繁琐的抗原蛋白的纯化工作。本研究通过杆状病毒表面展示技术将PPRV H糖蛋白展示于BmNPV病毒表面以研究其用于制备PPR疫苗的可行性。首先,通过递归PCR技术,我们合成了一段前后分别融合BmNPV GP64信号肽和跨膜区编码序列的PPRV H融合基因,即信号肽-PPRV H-跨膜序列(SHT)。然后,将该片段插入到pFastBac 1载体上构建了重组转移载体。将该重组转移载体转化E. coli DH10Bac细胞,经蓝白斑筛选获得重组Bacmid-SHT,PCR鉴定该Bacmid含有目的基因。用该Bacmid转染家蚕BmN细胞获得重组病毒BmNPV-SHT。通过RT-PCR和蛋白免疫印迹技术检测到接种重组病毒的BmN细胞和家蚕蚕蛹中目的基因的转录和表达。利用纯化的BmNPV-SHT病毒免疫小鼠,获得抗体效价为1:7000,血清中和实验测得中和效价为1:32,淋巴细胞增殖实验测得其SI值为6.1而对照组SI值为1.8,以上表明BmNPV-SHT作为免疫原能够刺激机体产生抗体和免疫细胞,具有良好的免疫原性。本研究证实了利用家蚕杆状病毒表面展示技术可有效在BmNPV病毒表面展示PPRV H蛋白,这为制备新型小反刍兽疫疫苗奠定了基础。

小反刍兽疫病毒H蛋白在家蚕杆状病毒表面的展示及其免疫原性研究

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