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蓖麻毒素和相思子毒素A链突变体疫苗候选抗原的研究

作　者: 韩艳辉
导　师: 王景林
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 蓖麻毒素相思子毒素突变体嵌合体蛋白疫苗候选抗原
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景:蓖麻毒素（ricin,RIC）和相思子毒素（abrin,ABR）是两种植物来源的、毒性强的蛋白质毒素,二者分子结构相似,其全毒素均是由A、B两条多肽链借助二硫键连接组成的异二聚体,相对分子质量在62～67 kDa之间。RIC和ABR均属于Ⅱ型核糖体失活蛋白（RIP）,它们的毒性作用机理相近,均是通过B链与细胞膜受体结合,帮助A链进入细胞质,从而发挥毒性作用。由于其毒性强、易于获得和可气溶胶化等特点,RIC和ABR被认为是重要的致死性生物毒素战剂和生物恐怖剂,其对社会公共安全的潜在威胁不容忽视。但是目前针对RIC和ABR生物防护的疫苗研究还较少,因此,发展有效的应对RIC和ABR生物战剂的医学防护疫苗,具有十分重要的军事和社会意义。目的:本研究的目的就是构建RIC A链突变体（mRICA）和ABR A链突变体（mABRA）以及RIC、ABR A链突变体的嵌合体蛋白（mRICA/mABRA）,实现mRICA、mABRA突变体蛋白和mRICA/mABRA嵌合体蛋白在原核表达系统内的可溶性表达、快速纯化及抗原性分析,将其作为免疫原免疫动物,评价其对抗天然RIC和ABR中毒的免疫保护作用,筛选出有效的候选抗原,为制备RIC和ABR A链突变体疫苗奠定基础。方法:通过定点突变的方法获得ABR A链突变体基因（mABRAE164AR167L和mABRAE164AR167LN200P）,构建重组表达质粒pETHis-mABRA1和pETHis-mABRA2,分别转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS和BL21（DE3）,经1.0 mM IPTG 30℃诱导表达,筛选出最佳表达工程菌BL21（DE3）pLysS/pETHis-mABRA1和BL21（DE3）pLysS/pETHis-mABRA2。应用前期已设计并合成的RIC A链突变体基因（mRICAD75AV76MY80A）,构建重组表达质粒pETHis-mRICA和pET28a-mRICA,分别转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS和BL21（DE3）,经0.5 mM IPTG 16℃诱导表达,筛选出最佳表达工程菌BL21（DE3）/pETHis-mRICA。采用柔性linker连接RIC A链突变体（mRICAD75AV76MY80A）和ABR A链突变体（mABRAE164AR167L）构建嵌合体基因mRICA/mABRA,将mRICA/mABRA嵌合体基因亚克隆至原核表达载体pQE-80L、pQE-30、pTIG-Trx、pET-28a ,构建重组表达质粒pQE80L-mRICA/mABRA、pQE30-mRICA/mABRA、pTIGTrx-mRICA/mABRA和pET28a-mRICA/mABRA,再分别转化至大肠杆菌M15或BL21（DE3）,工程菌在18℃经0.1 mM的IPTG诱导14 h ,筛选出最佳表达工程菌M15/pQE80L-mRICA/mABRA。表达的mRICA、mABRA1、mABRA2突变体蛋白以及mRICA/mABRA嵌合体蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,通过ELISA和WB印迹检测四种蛋白的抗原性。将纯化后的蛋白作为免疫原,采用以下五种形式与铝佐剂混合后分别免疫Balb/c小鼠:mRICA、mABRA1、mABRA2、mRICA和mABRA1混合物以及嵌合体蛋白mRICA/mABRA。每种免疫原分两种免疫途径:肌肉注射和皮下多点注射,免疫以后血清中抗体效价采用间接ELISA方法进行检测,用天然RIC和ABR对免疫后的Balb/c小鼠进行攻毒实验,或收集免疫鼠血清与天然RIC和ABR在体外进行中和,分析五种免疫原的免疫保护效果。结果:经过PCR和测序验证,所构建的突变体基因mABRAE164AR167L、mABRAE164AR167LN200P和mRICAD75AV76MY80A与预期结果完全一致,mABRAE164AR167L和mABRAE164AR167LN200P全长753bp,编码251个氨基酸残基,mRICAD75AV76MY80A全长801bp,编码267个氨基酸残基。重组表达质粒pETHis-mABRA1、pETHis-mABRA2、pETHis-mRICA和pET28a-mRICA经PCR及双酶切鉴定证明构建正确, mABRA1和mABRA2突变体蛋白的相对分子质量约为30 kDa, mRICA突变体蛋白的相对分子质量约为32 kDa,在大肠杆菌表达系统中均以可溶性和包涵体两种形式表达,可溶性的mABRA1、mABRA2和mRICA经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,蛋白纯度均达98.5%以上,mABRA1和mABRA2可与抗天然ABR兔多克隆抗体发生特异抗原抗体反应,mRICA可与抗天然RIC兔多克隆抗体发生特异抗原抗体反应。所获得的mRICA/mABRA嵌合体基因经一致性比对分析与预计嵌合基因的序列一致性为100%,其开放阅读框架全长1572 bp,编码524个氨基酸残基。重组表达质粒pQE80L-mRICA/mABRA、pQE30-mRICA/mABRA、pTIGTrx-mRICA/mABRA和pET28a-mRICA/mABRA经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,嵌合体蛋白相对分子质量约为62 kDa,与预测的相符,可溶性的嵌合体蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,纯度可达99%。间接ELISA和WB印迹结果表明,嵌合体蛋白能同时与抗RIC兔多克隆抗体和抗ABR兔多克隆抗体发生特异的抗原抗体反应。细胞毒性实验证明,突变体蛋白mRICA的毒性降低到rRICA的1/2500-4100,天然RIC的1/8200-10000,突变体蛋白mABRA1的毒性降低到rABRA的1/1350,天然ABR的1/8000,突变体蛋白mABRA2的毒性降低到rABRA的1/2700-2800,天然ABR的1/16000-17000。将mRICA、mABRA1、mABRA2蛋白分别免疫Balb/c小鼠,血清中检测到相应的抗mRICA或抗mABRA特异性抗体,将mRICA和mABRA1混合物以及嵌合体蛋白mRICA/mABRA分别免疫Balb/c小鼠,血清中可同时检测到抗mRICA和抗mABRA特异性抗体,间接ELISA结果表明,三免以后血清中相应抗体的效价均可达到1:106以上,而佐剂对照组则没有抗体产生,免疫组和对照组血清抗体效价的差异具有统计学意义（p<0.05）,而两种免疫途径,肌肉注射和皮下多点注射所产生的免疫效果没有明显差异（p>0.05）。用天然RIC和ABR对免疫小鼠进行攻毒试验,mRICA、mABRA1和mABRA2单独免疫组小鼠或抗血清可以抵抗最高剂量为10×LD₅₀的天然毒素的攻击,保护率均为100%。mRICA和mABRA1混合物免疫组可以抵抗最高剂量为5×LD₅₀天然RIC和ABR混合物的攻击,6×LD₅₀ RIC和ABR混合物攻击时保护率为80%,8×LD₅₀ RIC和ABR混合物攻击时保护率为20%;而mRICA/mABRA嵌合体蛋白免疫组可以抵抗最高剂量为6×LD₅₀ RIC和ABR混合物的攻击,8×LD₅₀ RIC和ABR混合物攻击时保护率为60%,mRICA/mABRA嵌合体蛋白可达到与mRICA和mABRA1混合物同样的免疫保护效果。结论:本研究成功构建并表达了突变体蛋白mRICA、mABRA1、mABRA2以及嵌合突变体蛋白mRICA/mABRA,实现了四种蛋白在原核表达系统内的可溶性表达,通过抗原性检测和细胞杀伤实验验证,所获得的突变体蛋白和嵌合体蛋白均保留了良好的抗原性,同时大大降低了毒性,小鼠免疫和攻毒实验结果表明利用构建的突变体蛋白和嵌合突变体蛋白作为免疫原作用于机体产生了良好的免疫刺激作用,免疫后小鼠或抗血清对致死剂量的天然RIC和ABR毒素的攻毒表现出较强的抵抗力和较好的免疫保护效果,为研制新型RIC和ABR疫苗奠定了重要基础。

全文目录

缩略词表  5-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
前言  14-17
第一部分重组相思子毒素A链突变体的构建、表达纯化和免疫效果评价  17-42
  引言  17
  1 实验材料  17-20
  2 实验方法  20-29
  3 实验结果  29-40
  4 小结  40-42
第二部分重组蓖麻毒素A链突变体的表达纯化和免疫效果评价  42-56
  引言  42
  1 实验材料  42-43
  2 实验方法  43-48
  3 实验结果  48-55
  4 小结  55-56
第三部分重组蓖麻、相思子毒素A链突变体的嵌合表达和免疫效果评价  56-72
  引言  56
  1 实验材料  56-57
  2 实验方法  57-63
  3 实验结果  63-70
  4 小结  70-72
讨论  72-77
结论  77-78
参考文献  78-81
综述  81-90
  参考文献  87-90
在读期间发表论文情况  90-91
发表论文  91-109
个人简历  109-110
致谢  110

蓖麻毒素和相思子毒素A链突变体疫苗候选抗原的研究

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