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临床级全长抗体基因治疗平台的建立

作　者: 范丽
导　师: 钱其军
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 杆状病毒-昆虫细胞系统 腺相关病毒 基因治疗 Cetuximab EGFR
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


单克隆抗体是目前靶标最明确的肿瘤治疗药物,临床应用安全性好,效果显著,具有巨大的市场。但是应用抗体进行治疗费用昂贵,一个疗程约需20万元,一般患者经济上难以承受。为此,我们实验室于2004年在国际上率先提出并建立全长抗体基因治疗策略,应用复制缺陷型腺病毒携带全长抗体基因,直接在体内(主要是肝脏)表达具有功能活性的全长抗体,并进入血液循环,达到肿瘤治疗目的。该策略省略了抗体制备与纯化的复杂工艺与步骤,因而显著降低了治疗费用。然而由于腺病毒的自身缺陷,该策略仍存在抗体表达量不够高,表达时间较短的缺陷。腺相关病毒(Adeno-associated Viruses,AAV)具有介导外源基因长期高效表达的特点,作为载体已在基因治疗的临床试验中获得成功,因而有望成为全长抗体基因治疗策略的良好载体。然而由于AAV的复制特性,高效、低成本的重组腺相关病毒(rAAV)的制备一直是AAV基础与临床应用领域的一大技术瓶颈。因此,为将腺相关病毒介导的全长抗体基因治疗成功推向临床应用,亟需建立一套稳定高效的rAAV的生产体系。杆状病毒-昆虫细胞表达系统是一种常用的真核细胞表达系统。作为一种昆虫病毒,杆状病毒同样可以像腺病毒或单纯疱疹病毒一样为AAV的复制提供辅助,但又不具有腺病毒和单纯疱疹病毒对人体的毒性,且病毒颗粒大,与AAV病毒颗粒差异显著,便于rAAV的分离纯化,同时其宿主昆虫细胞可以采取悬浮方式进行培养,生产工艺较为成熟,便于rAAV的规模化生产。因此,杆状病毒-昆虫细胞系统有望成为rAAV规模化生产的有效突破口。西妥昔(Cetuximab)单抗是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的单克隆抗体,在肿瘤的临床治疗中应用广泛。8型AAV具有强烈的肝脏的亲嗜性,是理想的全长抗体基因治疗载体。因此,本研究应用AAV8作为携带西妥昔全长单抗基因的载体,构建rAAV8- Cetuximab,并利用杆状病毒-昆虫细胞系统作为rAAV8-Cetuximab的生产制备系统,探索建立一套可用于临床治疗的全长抗体基因治疗策略。主要研究方法有:(1)构建三个重组杆状病毒载体,分别为含有AAV包装所需的Rep和Cap基因的BAPⅧ、含有Cetuximab全长基因的pABV359-Cetuximab,以及含有Cetuximab全长基因和土拨鼠转录调控元件(WPRE)基因的载体pABV359-Cetuximab-WPRE;(2)三个质粒载体通过DH10Bac细菌内重组并经过蓝白斑筛选得到相应的杆状病毒质粒;(3)在Sf9细胞中包装获得杆状病毒Bac-AAV2RepiCap8i、Bac-Cetuximab,杆状病毒的扩增及实时荧光定量PCR法测定杆状病毒的滴度,检测Bac-Cetuximab在Sf9细胞及HEK293细胞中Cetuximab的表达;( 4 ) Sf9细胞中包装获得rAAV8-Cetuximab及rAAV8-EGFP ,并以rAAV8-EGFP为对照,检测制备的腺相关病毒中杆状病毒灭活情况,rAAV8对HEK293细胞的感染活力,及rAAV8-Cetuximab在HEK293细胞中Cetuximab的表达量等。初步研究结果显示,利用双杆状病毒系统成功包装得到8型腺相关病毒,生产出的病毒rAAV8经HPLC纯化后,实时荧光定量PCR检测病毒载体基因组产量的结果显示,成功获得了高滴度的8型腺相关病毒,100mL摇瓶中可以包装获得1013v.g.的rAAV8病毒颗粒。以相同MOI值感染HEK293,对照病毒rAAV8-EGFP感染HEK293后,结果显示,感染rAAV8-EGFP的HEK293能表达较强的绿色荧光蛋白,说明8型腺相关病毒感染能力较强。同时,将rAAV8-Cetuximab感染HEK293细胞,96h后分别收集上清蛋白和细胞中蛋白,ELISA检测Cetuximab表达,检测结果显示,细胞中蛋白Cetuximab表达量达到176ng/mL,上清中测得的表达量为49.8ng/mL,但是细胞中与上清中总的Cetuximab表达水平相当,然而,rAAV8-Cetuximab在体外细胞中Cetuximab单抗表达量比较低,需要分析其原因,做进一步改进以提高表达量,同时,rAAV8-Cetuximab在体内表达水平有待进一步检测。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-13
缩略词表  13-14
第一章 前沿  14-22
  1 腺相关病毒载体及其生产方式  14-18
    1.1 腺相关病毒简介  14-15
    1.2 腺相关病毒载体  15
    1.3 腺相关病毒载体在基因治疗中的应用  15-16
    1.4 腺相关病毒载体生产方式研究进展  16-18
  2 西妥昔(Cetuximab)单抗及转录调控元件WPRE  18-20
    2.1 EGFR 及西妥昔Cetuximab 单抗研究进展  18-20
    2.2 转录调控元件WPRE  20
  3 课题创新点、研究内容  20-22
    3.1 课题创新点  20
    3.2 课题研究内容  20-22
第二章 重组载体的构建及 DH10Bac 菌内转座重组  22-49
  1 实验器材  22-26
    1.1 材料  22
    1.2 仪器和设备  22-23
    1.3 试剂及试剂盒  23-24
    1.4 主要试剂的配制  24-25
    1.5 所用引物  25-26
  2 实验方法  26-41
    2.1 重组载体构建  26-38
      2.1.1 BAPⅧ载体的构建  26-32
      2.1.2 pABV359-Cetuximab 载体的构建  32-34
      2.1.3 pABV359-Cetuximab-WPRE 载体的构建  34-37
      2.1.4 质粒的大量制备  37-38
    2.2 重组载体在DH10Bac~(TM)中的转座重组及重组Bacmid 的提取  38-39
      2.2.1 重组载体DH10Bac~(TM)中转座重组  38
      2.2.2 重组Bacmid 的大量抽提及PCR 鉴定  38-39
    2.3 pABV359-Cetuximab、pABV359-Cetuximab-WPRE 中Cetuximab 表达测定  39-41
      2.3.1 HEK293 细胞培养  39-40
      2.3.2 pABV359-Cetuximab、pABV359-Cetuximab-WPRE 质粒转染  40
      2.3.3 ELISA 检测Cetuximab 表达量  40-41
  3 结果  41-47
    3.1 AAV2cap8i 基因片段PCR 扩增结果  41-42
    3.2 重组BAPⅧ载体酶切鉴定  42-43
    3.3 pABV359-Cetuximab 载体构建相关电泳图  43-44
    3.4 pABV359-Cetuximab-WPRE 载体的构建  44-46
    3.5 重组Bacmid 的PCR 鉴定  46-47
    3.6 pABV359-Cetuximab、pABV359-Cetuximab-WPRE 质粒Cetuximab 表达量  47
  4 讨论  47-49
第三章 重组杆状病毒的包装、扩增及滴度测定  49-59
  1 实验器材  49-50
    1.1 材料与试剂  49
    1.2 仪器和设备  49-50
    1.3 荧光定量PCR 引物  50
  2 实验方法  50-54
    2.1 Sf9 细胞的培养  50
    2.2 重组杆状病毒的包装  50-51
    2.3 重组杆状病毒的扩增  51
    2.4 重组杆状病毒DNA 的提取  51-52
    2.5 荧光定量PCR 测定重组杆状病毒的滴度  52-54
      2.5.1 Bac-AAV2RepiCap8i 的滴度测定  52-53
      2.5.2 Bac-Cetuximab 的滴度测定  53-54
  3 结果  54-57
    3.1 重组杆状病毒的滴度测定  54-56
      3.1.1 Bac-AAV2RepiCap8i 的滴度测定  54-55
      3.1.2 Bac-Cetuximab 的滴度测定  55-56
    3.2 ELISA 检测Bac-Cetuximab 在Sf9 细胞及HEK293 细胞中的的表达情况  56-57
  4 讨论  57-59
第四章 重组 AAV 的生产、纯化、滴度和活力测定  59-68
  1 实验器材  59-60
    1.1 材料与试剂  59
    1.2 仪器和设备  59-60
    1.3 试剂的配制  60
  2 方法  60-62
    2.1 二杆状病毒包装系统包装获得rAAV8-EGFP、rAAV8-Cetuximab  60-61
    2.2 rAAV8-EGFP、rAAV8-Cetuximab 纯化及滴度测定  61
      2.2.1 rAAV8-EGFP、rAAV8-Cetuximab 的纯化  61
      2.2.2 rAAV8-EGFP、rAAV8-Cetuximab 滴度测定  61
    2.3 rAAV8-EGFP、rAAV8-Cetuximab 灭活情况及对HEK293 细胞感染力检测  61-62
      2.3.1 rAAV8-EGFP、rAAV8-Cetuximab 灭活情况检测  61-62
      2.3.2 rAAV8-EGFP 对HEK293 细胞感染力检测  62
    2.4 rAAV8-Cetuximab 在HEK293 细胞中Cetuximab 的表达测定  62
      2.4.1 rAAV8-Cetuximab 感染HEK293 细胞  62
      2.4.2 ELISA 方法检测抗体Cetuximab 的表达量  62
  3 结果  62-66
    3.1 rAAV8-EGFP、rAAV8-Cetuximab 滴度测定  62-64
    3.2 rAAV8-EGFP、rAAV8-Cetuximab 灭活情况及活力检测  64-65
      3.2.1 rAAV8-EGFP、rAAV8-Cetuximab 灭活情况检测  64-65
      3.2.2 rAAV8-EGFP 病毒活力检测  65
    3.3 rAAV8-Cetuximab 在HEK293 细胞中Cetuximab 抗体表达检测  65-66
  4. 讨论  66-68
总结  68-70
参考文献  70-75
附录  75-76
致谢  76

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 治疗学
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