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重组人胰高血糖素样肽-2二串体的制备及活性研究

作　者: 刘烁
导　师: 张英起
学　校: 第四军医大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 胰高血糖素样肽-2 串联体基因工程纯化生物学活性
分类号: TQ464.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

胰高血糖素样肽-2（glucagon-likepeptide-2,GLP-2）是胰高血糖素原基因（proglucagon,PG）衍生肽类（PGDP）之一，是一种肠道特异性营养因子，由33个氨基酸残基构成，序列为HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD，分子量约为3.9kDa[1]。GLP-2在肠道的生物学活性包括：促进小肠和大肠粘膜生长、抑制肠和隐窝细胞凋亡、促进肠内葡萄糖运输和GLUT-2表达、增加营养吸收、抑制胃排空和胃酸分泌、降低肠通透性、增高肠血流量等[2]。鉴于其上述生物学活性，它被开发用于短肠综合征、炎症性肠病和肠型放射病等疾病的治疗。此外，值得注意的是，GLP-2极易被二肽激酶IV（DPPIV）在其氮末端第二位的丙氨酸水解而失去活性，其在体内的半衰期仅为7min[3]。而如果用甘氨酸将丙氨酸替换，就可以抵抗DPPIV的水解而增长半衰期[4]。虽然GLP-2有广泛的应用前景，但大量的文献报道显示，目前应用于临床和实验的GLP-2及其类似物大多通过化学合成方法获得，而这种方法不但技术复杂、周期较长，而且成本较高[5]。此外，因为其分子量较小，通过基因工程使其在大肠杆菌中直接表达来大规模的生产也不太可能。这都大大限制了它在临床和实验研究中的广泛应用。如何快速、经济的获取具有活性的GLP-2或其类似物正是本课题将要解决的问题。本课题在优化GLP-2结构的基础上将其基因进行串联设计并合成，然后将其亚克隆到pET-22b载体，成功构建了人GLP-2二串体基因重组表达载体pET-22b(+)-GLP-2②，并将pET-22b(+)-GLP-2②转化到表达宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后能高水平表达目的蛋白GLP-2②，经过硫酸铵盐析粗提纯和阴离子交换柱层析精细提纯获得了高纯度的重组蛋白GLP-2②，经Tricine-SDS-PAGE、免疫印迹（Westernblot）和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定其为目的蛋白。通过体外GLP-2②对Caco-2细胞的促进增殖实验以及体内给予小鼠皮下注射GLP-2②能促进肠道细胞增殖及肠绒毛生长的实验，证明了通过基因方法获得的GLP-2②具有生物学活性且优于化学合成的GLP-2单体。本课题克服了GLP-2单体无法原核表达的缺陷，经过简单的技术即可制备大量的高活性GLP-2②，为其广泛应用于短肠综合征和肠型放射病等疾病的临床和实验研究奠定了一定的基础。

重组人胰高血糖素样肽-2二串体的制备及活性研究

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