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小反刍兽疫病毒F蛋白与H蛋白相互作用及F蛋白免疫原性研究

作　者: 杨香芳
导　师: 才学鹏
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 小反刍兽疫病毒融合蛋白吸附蛋白核酸疫苗
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

小反刍兽疫（Peste des petits Ruminants，PPR）是世界动物卫生组织（OIE）规定的A类烈性传染病，目前主要是用弱毒疫苗来免疫预防该病，但其具有生物安全方面的缺陷，核酸疫苗因具有制备简单、安全性好且可诱导体液免疫及细胞免疫反应而受到关注。血凝素蛋白H和融合蛋白F是小反刍兽疫病毒（PPRV）表面的两种糖蛋白，其中F蛋白具有协助病毒穿过细胞膜将基因组导入靶细胞中的作用，H蛋白则辅助F蛋白发挥作用，这两种蛋白不仅是小反刍兽疫病毒主要的毒力蛋白，同时也是主要的保护性抗原，是PPRV核酸疫苗研究的候选基因；开展这两种蛋白之间的作用研究对于探究PPRV的致病机理、为PPRV新型疫苗的研究具有指导意义。本研究根据PPRV Nigeria75/1株F基因序列设计引物，扩增了去除信号肽和跨膜区的F基因并克隆到pET-30a原核表达载体上，构建了原核表达质粒pET-30a/F，大量表达并纯化重组F蛋白，用纯化的F蛋白免疫青紫蓝家兔制备多克隆抗体,采用ELISA和Western-blot分析该抗体的特异性。结果显示制备的多克隆抗体具有较好的反应性和特异性。其次根据PPRV Nigeria75/1株H、F基因序列设计各设计了2对引物，其中一对引物均不加标签，而另一对引物在H基因的N-端加入HA标签、在F基因的N-端加入FLAG标签，运用RT-PCR方法从PPRV总RNA中成功扩增出H、F全基因片段，亚克隆到pCAGGS真核表达载体中，构建了pCAGGS-H、pCAGGS-F、pCAGGS-H/HA、pCAGGS-F/FLAG真核表达载体，经真核瞬时转染BHK-21、CHS20细胞后通过Western-blot、间接免疫荧光检测H、F蛋白的表达情况，同时用免疫共沉淀和融合实验方法检测H蛋白和F蛋白之间的相互作用，结果显示H、F蛋白在细胞中表达并且能够有效地发生相互作用，可导致细胞发生融合。在此基础上以重组质粒pCAGGS-F做为DNA疫苗，通过脚掌皮内注射免疫BALB/c小鼠，采用间接ELISA检测抗体的产生情况。结果显示，pCAGGS-F重组质粒在有无佐剂CpG的情况下均能诱导小鼠产生较高的抗体水平，说明该重组质粒是PPR DNA疫苗理想的候选材料，该研究为PPR新型、高效疫苗的研制奠定了基础。

全文目录

摘要  2-4
Abstract  4-6
英文缩略表  6-9
第一章文献综述  9-25
  1.1 小反刍兽疫研究进展  9-16
    1.1.1 概况  9
    1.1.2 病原学研究  9-12
    1.1.3 临床学研究  12-14
    1.1.4 诊断方法研究进展  14-15
    1.1.5 预防与控制  15-16
  1.2 副粘病毒 H、F 蛋白的研究进展  16-20
    1.2.1 H 蛋白  16-17
    1.2.2 F 蛋白  17-18
    1.2.3 H 蛋白和 F 蛋白的相互作用  18-20
  1.3 核酸疫苗的研究进展  20-24
    1.3.1 核酸疫苗的发展  20-21
    1.3.2 核酸疫苗的作用机理  21
    1.3.3 影响核酸疫苗免疫效果的因素  21-22
    1.3.4 核酸疫苗特点  22
    1.3.5 核酸疫苗的应用现状  22-23
    1.3.6 核酸疫苗存在的问题  23-24
  1.4 展望  24-25
第二章小反刍兽疫病毒 F 蛋白的原核表达及多克隆抗体制备  25-36
  2.1 试验材料  25-26
    2.1.1 主要试剂  25
    2.1.2 实验动物  25
    2.1.3 主要器材  25-26
  2.2 试验方法  26-30
    2.2.1 PPRV 基因组 RNA 的提取  26
    2.2.2 目的片段的扩增  26-27
    2.2.3 E.coli（DH5α）感受态细胞的制备（采用 TSS 法）  27
    2.2.4 pMD18-T/F 重组质粒的构建和鉴定  27-28
    2.2.5 原核表达重组载体 pET-30a/F 的构建和鉴定  28
    2.2.6 重组质粒 pET-30a/F 的诱导表达与鉴定  28-29
    2.2.7 蛋白纯化（切胶法）  29
    2.2.8 Western-blot 鉴定  29
    2.2.9 PPRV 多克隆抗体的制备  29-30
    2.2.10 多抗血清效价测定  30
    2.2.11 F 蛋白多抗的反应原性检测  30
  2.3 实验结果  30-34
    2.3.1 RT-PCR 扩增 F 基因  30-31
    2.3.2 重组质粒 pET-30a/F 的鉴定  31-32
    2.3.3 重组质粒 pET-30a/F 的表达  32
    2.3.4 重组原核蛋白的免疫原性鉴定  32-33
    2.3.5 多抗血清效价测定  33
    2.3.6 多抗的 Western-blot 鉴定  33-34
  2.4 讨论  34-36
第三章小反刍兽疫病毒 H、F 蛋白真核表达载体的构建及相互作用研究  36-47
  3.1 实验材料  36-37
    3.1.1 主要试剂  36-37
    3.1.2 主要器材  37
  3.2 实验方法  37-40
    3.2.1 RT-PCR 扩增 H、F 基因（两步法）  37-38
    3.2.2 重组真核表达质粒的构建与鉴定  38
    3.2.3 重组质粒与空载体质粒的提取  38
    3.2.4 转染 BHK-21 细胞  38
    3.2.5 间接免疫荧光检测  38-39
    3.2.6 Western-blot 检测  39
    3.2.7 免疫共沉淀检测 H 和 F 之间的相互作用  39
    3.2.8 融合实验  39-40
  3.3 结果  40-45
    3.3.1 RT-PCR 扩增 H、F 基因  40-41
    3.3.2 重组真核表达载体的构建与鉴定  41-42
    3.3.4 间接免疫荧光检测重组质粒在 BHK-21 细胞的表达  42
    3.3.5 Western-blot 检测重组质粒在 BHK-21 细胞的表达  42-43
    3.3.6 免疫共沉淀检测 H 和 F 之间的相互作用  43-44
    3.3.7 融合实验  44-45
  3.4 讨论  45-47
第四章小反刍兽疫病毒 F 基因核酸疫苗的初步研究  47-52
  4.1 实验材料  47
    4.1.1 蛋白及实验动物  47
    4.1.2 主要试剂  47
  4.2 试验方法  47-49
    4.2.0 重组质粒的大量制备  47-49
    4.2.1 实验动物及其分组  49
    4.2.2 间接 ELISA 检测 BALB/c 小鼠血清抗体  49
  4.3 实验结果  49-50
    4.3.1 ELISA 反应结果  49-50
  4.4 讨论  50-52
第五章结论  52-53
参考文献  53-60
致谢  60-61
作者简介  61-62

小反刍兽疫病毒F蛋白与H蛋白相互作用及F蛋白免疫原性研究

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