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大鼠ATF3基因克隆与表达及单克隆抗体的制备

作　者: 任琎
导　师: 王迎伟
学　校: 南京医科大学
专　业: 免疫学
关键词: ATF3 融合蛋白 原核表达 合成多肽 单克隆抗体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


第一部分大鼠ATF3基因原核表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化目的:构建包含大鼠激活转录因子3(activating transcription factor 3,ATF3)基因不同长度片段的3个重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达。方法:PCR扩增出大鼠ATF3基因及其截短片段,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,重组质粒pGEX-4T-1/ATF3, pGEX-4T-1/ATF3(129-546bp)和pGEX-4T-1/ATF3 (237-546bp)经酶切鉴定、核酸序列测定后转化大肠杆菌(E.coli)BL21和rosetta,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。通过SDS-PAGE,Western blot进行分析和鉴定,并且经过谷胱苷肽琼脂糖的层析柱层析纯化。结果:经酶切鉴定和核酸序列测定证实重组质粒构建正确。经过IPTG诱导以后,三个重组质粒在SDS-PAGE均未见到预期的目的条带,但是Western blot结果表明,质粒pGEX-4T-1/ATF3能在BL21中表达分子量为48KD的融合蛋白。融合蛋白用谷胱苷肽层析柱纯化,SDS-PAGE显示,纯化蛋白纯度较低。结论:成功构建了包含ATF3不同长度片段的3个重组原核表达质粒,其中pGEX-4T-1/ATF3能够在宿主菌BL21中正确表达。第二部分抗大鼠ATF3单克隆抗体的制备与鉴定目的:制备针对大鼠激活转录因子3(activating transcription factor 3,ATF3)蛋白的单克隆抗体。方法:根据软件合成偶联有匙孔绒血蓝蛋白(key hole limpet hemocyanin,KLH)的ATF3第168-181位氨基酸多肽,免疫Balb/c小鼠,体外将骨髓瘤细胞SP2/0和小鼠脾细胞融合,ELISA法筛选出阳性克隆,经有限稀释法以及三次亚克隆后筛选出能分泌抗ATF3蛋白第168-181位氨基酸多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞,快速定性试纸法对抗体的类型进行鉴定,并且通过Western blot鉴定此单克隆抗体的特异性。结果:经过三次亚克隆后得到一株能稳定分泌抗大鼠ATF3蛋白的单克隆抗体。快速定性试纸法鉴定此单克隆抗体的亚型为IgG1,轻链为κ链。Western blot结果显示这株单抗能够特异性识别细胞内以及宿主菌BL21表达的ATF3蛋白。结论:成功制备了一株抗大鼠ATF3蛋白的单克隆抗体,为进一步研究ATF3的生物学功能提供了有用的实验工具。

全文目录


缩写词表  4-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
第一部分 大鼠ATF3基因原核表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化  9-30
  前言  9-10
  材料和方法  10-15
  结果  15-23
  讨论  23-30
第二部分 小鼠抗大鼠ATF3单克隆抗体的制备与鉴定  30-48
  前言  30-31
  材料和方法  31-39
  结果  39-44
  讨论  44-48
参考文献  48-53
结论  53-54
  全文总结  53-54
附录一 综述激活转录因子3(ATF3)研究进展  54-69
  参考文献  61-69
附录二 攻读硕士学位期间公开发表的学术论文  69-70
致谢  70

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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