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多角体蛋白融合的OPG在大肠杆菌和家蚕细胞中的表达与活性测定

作　者: 丁鑫鑫
导　师: 张耀洲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 破骨细胞形成抑制因子 多角体 融合蛋白 纯化 降血钙活性 大肠杆菌表达系统 Bac-to-Bac表达系统
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


破骨细胞形成抑制因子（osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF或称Osteoprotegerin,OPG）是一种调节骨吸收的分泌型糖蛋白。这种糖蛋白称为骨保护素,是肿瘤坏死因子受体超家族的一员,具有降血钙和防止骨质流失的作用。目前OPG主要通过CHO细胞来表达,但其表达量较低。所以我们尝试利用基因工程的方法,探索一种或几种有效的表达系统用以大量制备具有生物活性的OPG。为了提高OPG的表达量,本研究通过融合家蚕杆状病毒多角体蛋白（Polyhedrin）分别在大肠杆菌和家蚕细胞中表达了OPG。首先,以重组病毒Bm-OPG DNA为模板,进行PCR扩增获得OPG基因。构建重组质粒pBacPAK8-OPG、pBacPAK8-Polh-OPG、pET-32a-OPG和pET-32a-Polh-OPG。将原核表达质粒pET-32a-Polh-OPG转化大肠杆菌BL21并诱导表达,以pET-32a-OPG为对照,分析其表达量。结果显示,在大肠杆菌中融合了Polh的OPG表达量明显提高。表达后的融合蛋白Polh-OPG以包涵体形式存在,经变性处理后用Ni2+亲和柱纯化,SDS-PAGE及Western blotting鉴定得到较纯蛋白。利用小鼠降血钙实验检测融合蛋白Polh-OPG的活性,结果表明Polh-OPG能够显著降低小鼠血清钙离子浓度,具有一定的生物活性。其次,为了分析融合蛋白Polh-OPG在家蚕细胞中的表达效果,我们构建了转移载体pFastBac HTb-Polh-OPG。利用Bac-to-Bac表达系统得到重组Bacmid-Polh-OPG,将其转染家蚕细胞后获得重组病毒Bm-Polh-OPG。Western blotting分析融合蛋白Polh-OPG与OPG的表达量差异。结果表明,融合蛋白Polh-OPG与OPG在家蚕细胞中的表达差异不明显。我们用同样的方法将以包涵体形式存在的融合蛋白Polh-OPG经变性处理后,用Ni2+亲和柱纯化,得到较纯的重组蛋白。小鼠降血钙实验表明在家蚕细胞中表达的Polh-OPG具有一定的生物活性。本研究为探索如何进一步提高OPG的表达量奠定了一定的基础。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-13
缩略语  13-14
第一部分 文献综述与实验设计  14-26
  第一章 文献综述  15-23
    1. 破骨细胞形成抑制因子研究进展  15-18
      1.1 OPG 的基因结构  15
      1.2 OPG 的蛋白结构  15-17
      1.3 OPG 的作用机理  17
      1.4 OPG 在骨疾病方面的潜在应用  17-18
      1.5 展望  18
    2. 杆状病毒表达载体系统研究进展  18-23
      2.1 杆状病毒的分类及形态特征  19
      2.2 杆状病毒表达载体系统  19-20
        2.2.1 家蚕BmNPV 表达系统相对于昆虫细胞AcMNPV 表达系统的优势  19-20
        2.2.2 杆状病毒表达系统的进展及展望  20
      2.3 Bac-to-Bac 杆状病毒表达载体系统简介  20-21
      2.4 杆状病毒多角体蛋白的概述  21-23
  第二章 实验方案设计  23-26
    1. 实验目的和意义  23-24
    2. 研究内容  24-25
    3. 实验流程图  25-26
第二部分 研究论文  26-65
  第一章 破骨细胞形成抑制因子在大肠杆菌中的融合表达、纯化及其生物活性测定  27-49
    1. 材料与试剂  27-33
      1.1 材料  27
      1.2 订购试剂  27-28
      1.3 自配试剂  28-33
    2. 方法  33-43
      2.1 重组质粒的构建  33-39
        2.1.1 重组病毒Bm-OPG DNA 的提取  33
        2.1.2 PCR 扩增目的片段  33-34
        2.1.3 凝胶回收、纯化PCR 产物  34
        2.1.4 目的片段 OPG/Polh-OPG 与载体 pBacPAK8、pET-32a、pBacPAK8-Polh、pBacPAK8-Polh-OPG 的双酶切回收  34-35
        2.1.5 CaC1_2 法制备E.coli TG1/ BL21 (DE3)感受态细胞  35-36
        2.1.6 连接反应  36-37
        2.1.7 连接产物的转化  37
        2.1.8 重组质粒的筛选与鉴定  37-39
      2.2 重组质粒的表达  39-40
        2.2.1 融合蛋白在大肠杆菌中的表达  39
        2.2.2 蛋白凝胶电泳检测  39-40
      2.3 融合蛋白的纯化  40-42
        2.3.1 包涵体的溶解与样品制备  40-41
        2.3.2 Ni-NTA 柱纯化融合蛋白  41
        2.3.3 包涵体的复性  41-42
        2.3.4 Western blotting 检测  42
      2.4 融合蛋白的生物活性测定  42-43
    3. 结果  43-47
      3.1 PCR 扩增目的基因  43
      3.2 重组质粒的构建  43-45
      3.3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定  45-46
      3.4 重组蛋白Polh-OPG 的降血钙活性  46-47
    4. 讨论  47-49
  第二章 破骨细胞形成抑制因子在家蚕细胞中的融合表达、纯化及其生物活性测定  49-65
    1. 材料与试剂  49-50
      1.1 材料  49
      1.2 订购试剂  49-50
      1.3 自配试剂  50
    2. 方法  50-58
      2.1 重组Bacmid-Polh-OPG 的构建  50-55
        2.1.1 转移载体pFastBac HTb-Polh-OPG 的构建  50-51
        2.1.2 DH10Bac 菌感受态的制备  51
        2.1.3 重组质粒的转化  51-52
        2.1.4 重组Bacmid 的提取  52
        2.1.5 重组Bacmid 的PCR 鉴定  52-55
      2.2 昆虫细胞的培养  55-56
        2.2.1 家蚕细胞BmN 贴壁培养  55
        2.2.2 细胞冻存  55
        2.2.3 细胞复苏  55-56
        2.2.4 病毒的扩增培养  56
        2.2.5 病毒滴度测定(终点稀释法)  56
      2.3 重组病毒Bm-Polh-OPG 的获得  56-57
        2.3.1 重组Bacmid-Polh-OPG 转染家蚕BmN 细胞  56-57
        2.3.2 重组病毒Bm-Polh-OPG 的PCR 鉴定  57
        2.3.3 目的蛋白在家蚕细胞中的表达分析  57
      2.4 融合蛋白的纯化  57
      2.5 融合蛋白的生物活性测定  57-58
    3. 结果  58-63
      3.1 重组质粒pFastBac HTb-Polh-OPG 的构建  58
      3.2 重组Bacmid 的构建及鉴定  58-59
      3.3 融合蛋白在家蚕细胞中的表达、纯化分析  59-62
      3.4 重组蛋白Polh-OPG 的降血钙活性  62-63
    4. 讨论  63-65
总结  65-66
参考文献  66-69
致谢  69

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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