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含蛋白转导域的SARA/SBD融合蛋白逆转高糖诱导的人腹膜间皮细胞转分化的研究

作　者: 李曼
导　师: 黄晨；孙世仁
学　校: 第四军医大学
专　业: 内科学
关键词: 蛋白转导域 SARA/SBD融合蛋白高糖上皮细胞向间质细胞转分化
分类号: R572.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景:腹膜纤维化（Peritoneal Fibrosis）是长期腹膜透析（Peritoneal Dialysis）患者常见的并发症,它可导致腹膜功能损害,超滤失败,最终将发展至腹膜衰竭而被迫终止腹透,一直尚未有较好的防治办法。研究证实,腹膜间皮细胞（HPMC）的上皮细胞向间质细胞转分化（epithelial-to-mesenchy- mal transition,EMT）是腹膜纤维化的早期机制,其在腹膜纤维化的发生及进展为腹膜衰竭过程中起关键作用。SARA/SBD（Smad anchor for receptor activation/ Smad-binding domain）是纤维化形成过程中的负性调节因子,有望成为有效的腹膜纤维化防治药物。目的:原核表达、纯化TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,并研究其逆转高糖诱导的HPMC转分化的作用及可能机制。方法:1.将TAT PTD-SARA/SBD基因克隆入带His标签的原核表达载体pET-44a（+）中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物经Ni²⁺-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白;2.使用HPMC,通过免疫细胞化学方法检测其穿膜能力及与TGF-β1信号通路中Smad2因子的共定位情况;3.使用HPMC,通过免疫印迹法（Western blot）检测上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和Smad2/3、磷酸化Smad2/3（pSmad2/3）蛋白水平,检测其对高糖刺激下HPMC的EMT作用及可能机制。结果:应用基因工程方法成功表达和纯化了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,结果显示:目的蛋白约占菌体总蛋白的20%左右,且以可溶形式表达,经Ni²⁺-NTA纯化后,所获蛋白纯度大于95%。功能学实验结果显示:1.该蛋白能穿过胞膜主要定位于胞核,且与Smad2因子具有核内共定位;2.该蛋白可显著上调高糖刺激后HPMC的E-cadherin蛋白表达,下调α-SMA蛋白表达水平;3.该蛋白可下调pSmad2表达,对pSmad3的表达无明显影响。结论:1.成功表达了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白;2.该蛋白可高效穿膜,并与Smad2因子核内共定位,其可抑制高糖刺激下HPMC的上皮细胞向间质细胞转分化作用;3.可能机制为重组融合蛋白作用于Smad2,抑制Smad2的磷酸化水平,而对Smad3无明显影响。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
前言  13-15
文献回顾  15-31
实验一重组TAT PTD-SARA/SBD 融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定  31-45
  引言  31
  1 材料  31-35
  2 方法  35-38
  3 结果  38-43
  4 讨论  43-45
实验二重组TAT PTD-SARA/SBD 融合蛋白逆转高糖诱导的 HPMC 转分化  45-54
  引言  45
  1 材料  45-46
  2 方法  46-49
  3 结果  49-52
  4 讨论  52-54
实验三重组TAT PTD-SARA/SBD 融合蛋白逆转高糖诱导的 HPMC 转分化的机制研究  54-60
  引言  54
  1 材料  54
  2 方法  54-56
  3 结果  56-57
  4 讨论  57-60
小结  60-61
参考文献  61-70
个人简历和研究成果  70-71
致谢  71

含蛋白转导域的SARA/SBD融合蛋白逆转高糖诱导的人腹膜间皮细胞转分化的研究

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