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猪流行性腹泻病毒N蛋白基因的遗传变异及其原核表达

作　者: 彭滔
导　师: 王印
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪流行性腹泻病毒 N蛋白基因基因序列原核表达
分类号: S852.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

猪流行性腹泻英文简称PED,是由冠状病毒猪流行性腹泻病毒(英文简称PEDV)引发的一种猪高度接触性、急性、高致病性肠道传染病。本病的致病机理、流行特点、病理变化和临床症状都与猪传染性胃肠炎(英文简称TGEV)十分相似。本病已成为重要的猪病毒性腹泻病,对世界各地养殖场带来了巨大经济损失。现目前,主要采用弱毒或灭活疫苗进行防控,但免疫保护效果不太好。N蛋白是冠状病毒结构蛋白中的一种多功能磷酸化蛋白质,是冠状病毒在感染细胞中产生病毒最多的蛋白之一,有结构高度保守的特性,有利于建立高效、准确、快速的分子生物诊断技术。本实验从四川某猪场感染猪流行性腹泻致死猪的肠系膜淋巴结和脱落肠黏膜组织中分离出疑似猪流行性腹泻病毒,命名为SC-P1。提取PEDV的总RNA,然后通过反转录实验将RNA反转录成cDNA。参照N蛋白基因组序列,以cDNA为模板,primer5.0软件为依托,设计含有BamHI和XhoI酶切位点的PCR上下引物各一对,利用PCR技术扩增出目的基因N,克隆入pMD19T Simple Vecter载体中,构建重组质粒,经酶切、胶回收后进行克隆测序及分析鉴定。运用DNAstar、MEGA version4.0软件,对其进行基因比对及遗传进化分析。将鉴定准确的目的基因转入pET32a原核表达载体中,构建重组质粒,转入到大肠杆菌BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达。收集、纯化表达的蛋白,利用SDS-PAGE、Western-blot技术,确定重组蛋白能与抗PEDV血清进行特异免疫印迹反应,说明该重组蛋白具有抗原特异性。实验证明：目的基因核苷酸序列大小为1326bp,编码氨基酸441aa。将N蛋白基因克隆到原核表达载体pET32a上,构建了重组表达质粒pET32a-N,让pET32a-N转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)进行IPTG诱导表达发现,最佳表达条件是IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导时间为6h时。通过SDS-PAGE电泳表达出了大小约为71KU的重组蛋白。重组蛋白在菌体中以包涵体的形式存在,通过western blot结果显示,PEDV N蛋白与PEDV抗血清具有反应原性,对进一步开展PEDVN蛋白的研究具有一定指导意义。为了解PEDV毒株N蛋白基因的变异情况,将扩增出的PEDVN蛋白基因序列,与Genbank发表的10种国内主要PEDV毒株N蛋白基因进行核苷酸序列同源性和编码氨基酸同源性分析,结果显示分离株与参考株核苷酸同源性为94.8%-99.7%,其编码氨基酸同源性为94.1%-99.1%,说明PEDVN蛋白基因具有非常好的保守性,也证明了N蛋白基因克隆的成功。利用MEGA分析软件构建的系统进化树,可以分析出与CV777参考毒株亲缘关系最近,而与AFU07541(JN601057)和AEE38483(HQ455345)参考毒株亲缘关系最远。分离株N蛋白基因序列与10株PEDV参考株的对应序列进行比较分析,发现没有存在碱基的插入和缺失的现象,但存在突变点。与标准毒株CV777核苷酸序列进行比对,有4个碱基位发生了替换,分别在286bp处C-T发生了替换,1085bp处G-C发生了替换,1126bp处T-A发生了替换,1159bp处C-A发生了替换。与标准CV777N蛋白的氨基酸序列相比对,有3个氨基酸残基发生了替换,分别在96aa出现了L-F氨基酸残基替换,375aa出现了S-T氨基酸残基替换,366aa出现了Q-K氨基酸残基替换。这是由于核苷酸突变而导致了氨基酸残基变化,也说明了PEDVN蛋白基因具有4个高突变点。为进一步研究PEDVN蛋白基因变异情况和变异方式作出了参考。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-12
1 文献综述  12-25
  1.1 病原学  13-14
    1.1.1 病毒分类  13
    1.1.2 病毒形态和生物特性  13-14
    1.1.3 细胞培养  14
  1.2 PEDV分子生物学特性  14-17
    1.2.1 非结构蛋白  15
    1.2.2 结构蛋白  15-17
  1.3 流行病学及致病机理  17-19
    1.3.1 流行病学  17-18
    1.3.2 流行现状  18-19
  1.4 致病机理  19-20
  1.5 诊断  20-23
    1.5.1 临床症状和病理变化诊断  20-21
    1.5.2 病原学诊断  21
    1.5.3 血清学诊断  21-23
    1.5.4 分子生物学诊断  23
  1.6 预防与控制  23-24
  1.7 本研究的目的、意义  24-25
2 材料  25-30
  2.1 实验材料  25-26
    2.1.1 病料来源  25
    2.1.2 载体  25
    2.1.3 细胞、菌株及血清  25
    2.1.4 主要试剂  25-26
  2.2 主要实验仪器  26
  2.3 主要溶液配制  26-30
    2.3.1 琼脂糖电泳所用溶液的配制  26-27
    2.3.2 细菌培养液的配制  27
    2.3.3 SDS-PAGE所用溶液的配制  27-28
    2.3.4 蛋白纯化相关溶液的配制  28
    2.3.5 Western-Blot相关溶液的配制  28
    2.3.6 其他试剂的配制  28-30
3 实验方法  30-45
  3.1 PEDV的分离鉴定及其生物学特性研究  30-32
    3.1.1 病毒分离  30
    3.1.2 病毒的鉴定试验及蚀斑形成试验  30
    3.1.3 病毒鉴定  30-32
  3.2 PEDV N基因的克隆及表达载体的构建  32-38
    3.2.1 PEDV基因组RNA的提取  32-33
    3.2.2 RNA反转录  33
    3.2.3 引物的设计与合成  33
    3.2.4 目的基因的体外扩增  33-34
    3.2.5 目的片段的凝胶回收  34-35
    3.2.6 pMD-N载体的构建  35-36
    3.2.7 克隆子的筛选和鉴定  36-38
  3.3 N蛋白基因序列分析  38-39
  3.4 N蛋白的体外表达  39-45
    3.4.1 pET32a-N原核表达质粒的构建  39
    3.4.2 pET32a-N重组质粒的筛选和鉴定  39-40
    3.4.3 重组质粒的原核表达  40
    3.4.4 表达产物的检测  40-42
    3.4.5 表达条件的优化  42
    3.4.6 包涵体的溶解  42
    3.4.7 存在于沉淀中的蛋白层析纯化  42-43
    3.4.8 包涵体的复性  43
    3.4.9 Western Blot检测  43-45
4 结果  45-58
  4.1 病毒的分离鉴定及分子生物学研究  45-46
    4.1.1 病毒的分离培养  45
    4.1.2 病毒TCID50  45
    4.1.3 PCR鉴定  45-46
  4.2 N基因的克隆及表达载体的构建  46-49
    4.2.1 N基因的PCR扩增  46
    4.2.2 pMD-N质粒的鉴定  46-49
  4.3 N蛋白基因序列分析  49-53
    4.3.1 N蛋白基因序列同源性分析  49-51
    4.3.2 PEDV N蛋白基因进化树分析  51-52
    4.3.3 原核表达质粒pET32a-N的鉴定  52-53
  4.4 pET32a-N质粒的原核表达  53-58
    4.4.1 表达产物的SDS-PAGE电泳  53-54
    4.4.2 表达条件优化  54-56
    4.4.3 蛋白的纯化  56-57
    4.4.4 Western blot鉴定  57-58
5. 讨论  58-62
  5.1 病毒的生物学特性  58-60
  5.2 目的基因的选择  60-61
  5.3 重组质粒的蛋白表达  61
  5.4 N蛋白基因遗传演化的分析  61-62
6 结论  62-64
参考文献  64-70
致谢  70

猪流行性腹泻病毒N蛋白基因的遗传变异及其原核表达

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