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自溶链霉菌almR Ⅰ和almR Ⅱ基因在自溶霉素生物合成中的调控作用

作　者: 郑世超
导　师: 鲁涛；罗瑛
学　校: 昆明理工大学
专　业: 微生物学
关键词: 自溶链霉菌 自溶霉素 LuxR家族蛋白 基因调控
分类号: R915
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


近年来,以热休克蛋白Hsp90为靶目标正逐渐成为抗肿瘤药物研究领域的热点。作为具有代表性的一类针对Hsp90的抗肿瘤化合物,苯醌安莎类抗生素格尔德霉素(geldanamycin, GM)及其结构类似物一直是人们关注的焦点。这类化合物能够通过抑制Hsp90的功能使肿瘤细胞内诸多重要蛋白质迅速降解,从而抑制肿瘤细胞的生长或引发肿瘤细胞自发凋亡。我们在前期工作中从放线菌新种自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus)的次生代谢产物中发现了一个具有抗肿瘤活性的化合物,称为自溶霉素(autolytimycin)。自溶霉素与GM结构类似,是我们具有自主知识产权、已被证实抗肿瘤活性优良的新化合物,具有成为新型抗肿瘤药物的良好前景。但是目前我们对于参与自溶霉素生物合成相关基因的功能及其调控机制知之甚少,使得我们无法通过遗传改造有效地提高自溶霉素产量并获得新的结构类似物。为了了解自溶霉素生物合成的调控机制,我们开展了对自溶链霉菌中两个LuxR家族调控蛋白AlmRⅠ和AlmRⅡ的功能研究。我们根据本实验室克隆并测序的自溶霉素生物合成全基因簇DNA设计引物,以自溶链霉菌染色体DNA为模板,PCR扩增了以lmRⅠ基因和almRⅡ基因。所扩增基因克隆至表达载体pET28a,通过诱导成功表达了AlmRⅠ和AlmRⅡ蛋白,并最终纯化出AlmRⅠ蛋白。通过对自溶霉素生物合成基因簇的生物信息学分析,我们在几个可能参与自溶霉素合成的基因启动子区发现了LuxR家族蛋白的结合位点。利用PCR扩增得到了这些基因的启动子区,然后通过凝胶阻滞实验对纯化的AlmRⅠ蛋白与所扩增片段的结合进行了研究。结果表明在加入培养液上清的条件下,AlmRⅠ与almK基因的启动子区有结合现象,说明AlmRⅠ蛋白可能参与调控almK基因的表达。同时,实验显示在现有条件下,AlmRⅠ与almF和almO基因的启动子区没有结合,可能与这些基因的表达无关。本研究的目的在于了解自溶霉素生物合成过程中almRⅠ和almRⅡ因所起的作用。该研究有助于我们探明自溶霉素生物合成的调控机制,为将来对产生菌进行遗传工程改良以提高自溶霉素产量和合成新的化合物奠定基础。

全文目录


摘要  4-5ABSTRACT  5-7目录  7-10插图和附表清单  10-13第一章 序言  13-29  1.1 苯醌安莎类抗生素  13-17    1.1.1 研究背景  13    1.1.2 抗肿瘤机制  13-14    1.1.3 生物合成  14-16    1.1.4 调控机制  16    1.1.5 自溶霉素  16-17  1.2 LuxR家族调控蛋白  17-27    1.2.1 细菌群体感应  17-19    1.2.2 LuxR在细菌中的分布  19    1.2.3 LuxR家族蛋白结构  19-21    1.2.4 LuxR与AHL的结合  21-22    1.2.5 LuxR家族蛋白的调控机制  22-26    1.2.6 LuxR家族蛋白调控总结  26-27    1.2.7 LuxR家族蛋白的研究展望  27  1.3 研究目的和意义  27-29第二章 材料与方法  29-53  2.1 菌株、载体、培养条件  29-30  2.2 引物  30  2.3 抗生素、酶、抗体和试剂盒  30-31  2.4 基因组DNA的提取  31  2.5 PCR扩增  31-32  2.6 PCR产物回收纯化  32-33  2.7 琼脂糖凝胶电泳  33  2.8 质粒提取  33-35  2.9 限制性内切酶酶切反应  35  2.10 DNA片段与载体连接  35  2.11 制备感受态细胞  35-36  2.12 转化  36  2.13 almRⅠ和almRⅡ基因的表达  36-37  2.14 SDS-PAGE检测  37  2.15 包涵体纯化、变性及复性  37-39  2.16 蛋白纯化  39  2.17 Bradford法检测蛋白含量  39-40  2.18 Western blot  40  2.19 凝胶阻滞(EMSA)  40-44  2.20 主要仪器设备  44-46  2.21 试剂和配方  46-53第三章 结果与讨论  53-74  3.1 almRⅠ和almRⅡ基因克隆  53-57    3.1.1 almRⅠ和almRⅡ基因扩增  53-55    3.1.2 克隆载体的制备  55-56    3.1.3 连接与转化  56-57  3.2 AlmRⅠ和AlmRⅡ蛋白的表达  57-60  3.3 AlmRⅠ蛋白的纯化  60-66    3.3.1 AlmRⅠ包涵体提取和纯化  60-64    3.3.2 AlmRⅠ蛋白的过柱纯化  64-66  3.4 AlmRⅡ蛋白的纯化  66-67  3.5 LuxR结合域分析  67-68  3.6 AlmRⅠ与靶DNA的结合  68-74    3.6.1 靶DNA的PCR扩增  68-69    3.6.2 AlmRⅠ与almK的结合  69-71    3.6.3 AlmRⅠ与almM、almO和almF启动子的结合  71-74第五章 总结与展望  74-76致谢  76-77参考文献  77-85附录A 攻读硕士期间发表论文目录  85-86附录B 其他需要说明的内容  86

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学 > 药物生物学
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