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不结球白菜耐热性鉴定方法及其耐热基因片段克隆研究

作　者: 胡俏强
导　师: 袁希汉
学　校: 南京农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 不结球白菜耐热性鉴定热害指数生理生化特性热激蛋白基因克隆
分类号: S634
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

根据夏季自然高温条件下观察结果,选取耐热性差异明显的10份不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis Makino)为试验材料,探索出一套较为准确的不结球白菜苗期耐热性鉴定方法；研究了夏季高温季节栽培条件下的成株期形态指标与各品种耐热性的相关性；阐明了不结球白菜在热激条件下相关生理生化特性与品种耐热性的关系；同时还从不结球白菜中克隆得到一个小分子量热激蛋白基因BOHSP612,为进一步研究不结球白菜中热激蛋白基因打下了基础。本文主要研究结果如下：1.不结球白菜苗期耐热性鉴定采用人工气候箱高温处理方法,分别于2009年秋季和2010年春、夏季,在6种不同的高温条件下对10份不结球白菜材料进行了连续7d的高温处理。结果表明,在不同的高温胁迫下,各供试材料均会出现不同程度的热害症状,如叶片反卷、失绿等,并随着温度的升高和处理时间的延长,热害症状加剧。春季和秋季采用37℃/27℃(d/n)处理幼苗4d后调查热害指数,可以显著反映出不结球白菜各品种间的耐热性差异。而夏季自然高温条件下育苗后在37℃/27℃(d/n)则下不能区分不结球白菜各品种间耐热性差异。2.不结球白菜成株期耐热性鉴定采用田间自然高温鉴定方法,分别于2010年春季和夏季,对上述10份不结球白菜进行成株期耐热性鉴定,并计算其与苗期热害指数间的相关系数。结果表明,春季不结球白菜成株期各项形态指标中除叶宽与苗期热害指数显著相关外,其余指标均不显著。而夏季不结球白菜成株期形态指标中叶片数与苗期热害指数呈负相关,其余指标均呈正相关；其中株幅、叶长和叶宽与苗期热害指数呈显著正相关,叶柄长与其相关性达到极显著水平。3.不结球白菜生理生化指标耐热性鉴定以不结球白菜苗期鉴定结果中的耐热品种雪克青和高华青,中等耐热品种三伏和抗热605以及热敏品种四月慢和矮脚黄为试验材料进行连续10天的热激处理,测定了热激处理对不结球白菜叶片中叶绿素含量、膜透性、丙二醛(MDA)、保护酶活性以及脯氨酸(Pro)含量的影响。结果表明,热激处理后,耐热品种叶片中Pro含量和SOD、POD、CAT活性的相对增幅大于热敏品种,且分别处理4(Pro)、6(SOD、CAT)和8(POD)天可以显著区分各品种间耐热性；热敏品种叶片中电导率和丙二醛(MDA)的含量的相对增幅大于耐热品种,并且处理6(电导率)和8(MDA)天效果最佳,可作为鉴定标准之一；同时热敏品种叶片中总叶绿素和叶绿素a含量相对降幅大于耐热品种,并且第4(叶绿素a)和6(总叶绿素)天耐热品种相对降幅最小,热敏品种最大,中等耐热品种居中,各品种之间差异显著,可以作为耐热性鉴定的标准。然而研究发现叶绿素b含量变化较为复杂与各品种间耐热性无显著相关。4.不结球白菜耐热相关基因特异片段的克隆利用已发表的甘蓝耐热相关蛋白基因序列设计引物,以不结球白菜抗热品种高华青幼苗为试验材料,通过特异片段扩增,获得了不结球白菜耐热基因特异片段序列,命名为BOHSP612。序列分析发现,不结球白菜BOHSP612基因核苷酸特异片段序列长度为612bp。用BLAST进行同源性分析发现它们编码的核苷酸序列与一些芸薹属作物、拟南芥、大豆、花生等核基因组部分序列、耐热相关蛋白mRNA序列以及一些假基因和假定蛋白mRNA序列有较高同源性。

全文目录

摘要 8-10ABSTRACT 10-13缩略语表 13-14前言 14-16第一章文献综述 16-40 1 植物热害的基本概念及表现 16-17 2 植物高温胁迫的温度和类型 17-18 2.1 高温胁迫温度 17-18 2.2 高温胁迫类型 18 3 高温伤害植物的机理 18-19 3.1 间接伤害 18 3.2 直接伤害 18-19 4 植物耐热性鉴定方法研究进展 19-35 4.1 田间自然高温鉴定法 19-21 4.1.1 高温对植物营养生长的影响 19-20 4.1.2 高温对植物生殖生长的影响 20-21 4.2 种子活力鉴定方法 21-22 4.2.1 种子活力的定义 21-22 4.2.2 种子活力指标测定 22 4.3 人工模拟高温逆境鉴定法 22-23 4.4 实验室间接鉴定法 23-35 4.4.1 显微结构和超微结构的研究 24-25 4.4.2 生理生化指标研究 25-32 4.4.3 分子标记研究 32-33 4.4.4 热激蛋白研究 33-35 5 不结球白菜耐热性研究进展 35-37 5.1 耐热鉴定指标研究 35-36 5.1.1 形态学指标鉴定 35-36 5.1.2 生理生化指标鉴定 36 5.1.3 显微结构研究 36 5.2 耐热遗传规律 36 5.3 耐热分子标记研究 36-37 5.4 热激蛋白研究 37 6 耐热鉴定研究存在的问题及展望 37-40第二章不结球白菜耐热性鉴定的形态指标 40-54 1 材料与方法 42-43 1.1 试验材料 42 1.2 试验方法 42-43 1.2.1 苗期耐热性鉴定 42 1.2.2 成株期耐热性鉴定 42-43 2 结果与分析 43-51 2.1 高温处理下不结球白菜苗期热害症状表现 43-44 2.2 不同季节,不同温度处理下不结球白菜苗期热害指数 44-48 2.2.1 春、秋季育苗的平均苗期热害指数 44-48 2.2.2 夏季育苗的苗期平均热害指数 48 2.3 成株期田间耐热性鉴定 48-51 2.3.1 田间温度调查 48-49 2.3.2 春、夏季节成株期形态指标与苗期热害指数相关性 49-51 3 讨论 51-53 3.1 不结球白菜热害指数与耐热相关性 51-52 3.2 不结球白菜苗期热害表现及耐热性鉴定 52 3.3 不结球白菜成株期形态指标与苗期热害指数相关性 52-53 4 结论 53-54第三章不结球白菜耐热性鉴定的生理生化指标 54-74 1 材料与方法 56-57 1.1 试验材料 56 1.2 试验方法 56 1.3 测定项目及方法 56-57 1.3.1 叶绿素含量测定 56 1.3.2 电导率测定 56 1.3.3 丙二醛含量(MDA)测定 56-57 1.3.4 保护酶(POD、CAT、SOD)活性测定 57 1.3.5 游离脯氨酸含量测定 57 2 结果与分析 57-69 2.1 高温胁迫对不结球白菜幼苗叶片叶绿素含量的影响 57-61 2.1.1 高温胁迫对不结球白菜幼苗叶片总叶绿素含量的影响 57-58 2.1.2 高温胁迫对不结球白菜幼苗叶片叶绿素a含量的影响 58-60 2.1.3 高温胁迫对不结球白菜幼苗叶片叶绿素b含量的影响 60-61 2.2 高温胁迫对膜脂过氧化的影响 61-64 2.2.1 高温胁迫对膜透性的影响 61-63 2.2.2 高温胁迫对MDA含量的影响 63-64 2.3 高温胁迫对保护酶活性的影响 64-68 2.3.1 高温胁迫对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响 64-65 2.3.2 高温胁迫对过氧化氢酶(CAT)活性的影响 65-67 2.3.3 高温胁迫对过氧化物酶(POD)的影响 67-68 2.4 高温胁迫对游离脯氨酸含量的影响 68-69 3 讨论 69-72 3.1 不结球白菜叶绿素含量与耐热性的关系 69-70 3.2 不结球白菜膜脂稳定性与耐热性的关系 70-71 3.3 不结球白菜保护酶活性与耐热性的关系 71-72 3.4 不结球白菜游离脯氨酸含量与耐热性关系 72 4 结论 72-74第四章不结球白菜耐热相关基因特异片段的克隆 74-84 1 材料与方法 75-77 1.1 试验材料 75 1.2 试验方法 75-77 1.2.1 不结球白菜叶片DNA的提取 75-76 1.2.2 引物的设计 76 1.2.3 PCR扩增 76 1.2.4 目的片段回收、克隆及测序 76-77 2 结果与分析 77-82 2.1 DNA检测结果 77-78 2.2 不结球白菜耐热相关蛋白基因特异片段的获得、克隆、测序及序列分析 78-82 3 讨论 82-83 4 结论 83-84全文结论 84-86参考文献 86-96创新之处 96-98攻读硕士期间发表论文 98-100致谢 100

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