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粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32-1和L32-2功能的初步研究

作　者: 李雪松
导　师: 袁生
学　校: 南京师范大学
专　业: 生物技术
关键词: 酵母 核糖体蛋白 细胞絮凝 蛋白相互作用
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的核糖体蛋白RPL32的由两个同源基因：rp132-1和rp132-2共同编码。本实验室前期研究发现S. pombe核糖体蛋白RPL32-2具有潜在的转录激活功能。在进一步研究RPL32-2功能时,我们发现RPL32蛋白基因敲除突变体rp132-1△菌株和rp132-2△菌株在营养丰富的液体培养基中培养时会发生絮凝现象,并且证实这种絮凝现象是由细胞壁表面某种糖蛋白引起的。为了找到这个引起细胞絮凝的细胞壁蛋白,我们通过qRT-PCR技术,分析了野生型裂殖酵母菌株与絮凝菌株rp132-1△和rp132-2△部分细胞壁表面蛋白的转录水平。结果发现,rp132-1△和rp132-2△菌株的细胞壁蛋白基因SPAC186.01, SPBC947.04, SPAC977.07c, fta5和gas1表达量上升,其中SPAC186.01, SPAC977.07c有较大幅度的上升。我们猜想这其中的某个或几个基因编码的蛋白是引起细胞絮凝的表面黏附因子。接着,我们构建了SPAC186.01, SPBC359.04c, SPAC977.07c, fta5, gasl等5个基因的过表达菌株,结果发现5个过表达菌株中都没有絮凝产生。同时,分别敲除絮凝菌株rP132-1△基因组上的SPAC186.01, SPAC977.07c, gasl基因后,我们发现细胞的絮凝现象并没有消除。由此,我们推测由核糖体基因敲除而引发细胞絮凝可能并不是由单个基因引起的,而是多个基因相互作用的结果,而这些基因的高表达只是产生絮凝一个必要条件。并且细胞絮凝现象是由多个细胞表面絮凝蛋白共同引起的,这些蛋白在结构和功能上有很大的相似性,当我们敲除其中的一个后,其它絮凝因子可以替代其功能,因此絮凝现象并没有消除。为了验证核糖体蛋白表达不足引起细胞絮凝这一现象是否为S.pombe所特有的,我们选取了S. cerevisiae作为材料,来验证这一现象是否具有普遍性。首先我们敲除了S. cerevisiae核糖体蛋白编码基因rpll5A和rps26B,结果S.Cerevisiae并没有像S.pombe一样产生絮凝现象。接着,我们利用基因定点突变技术构建了S. cerevisiae絮凝菌株,通过荧光定量PCR分析其部分核糖体蛋白基因的表达情况,发现絮凝菌株的核糖体蛋白基因表达量并没有下降。另外,我们分析了S. cerevisiae在有性絮凝时核糖体蛋白基因的表达量,发现其表达量也没有下降,相反部分核糖体蛋白基因表达量还有所上升。综合这些研究结果,我们不难看出,S.cerevisiae中并不存在像粟酒裂殖酵母中核糖体蛋白表达量不足而引起细胞絮凝的现象,这说明这一现象是S.pombe所特有的。本实验室前期的研究发现RPL32-2具有潜在的转录调控作用,而RPL32-1则没有。为了进一步研究RPL32-1和RPL32-2的功能,我们分别构建了过表达RPL32-1和RPL32-2的菌株,结果发现,过表达RPL32-1菌株在EMM培养基中生长速度比野生型慢,到稳定期后有少量异形细胞出现,流式细胞分析发现过表达RPL32-1菌株中有大量1C细胞,并且有较强的热抗性。这些现象说明RPL32-1和RPL32-2在功能上存在差异性,最终通过Co-IP技术,我们筛选到一个可能特异结合RPL32-1的蛋白Grsl (mitochondrial and cytoplasmic glycine-tRNA ligase)。为了进一步确认Grsl与RPL32-1和RPL32-2之间是否存在相互作用,我们通过酵母双杂交来进一步分析。结果显示Grs1与RPL32-1和RPL32-2之间是都不存在相互作用。由于酵母双杂交存在局限性(如有时会产生假阴性结果,只能检测蛋白间直接的相互作用等),因此我们还需要通过其它的方法来进一步来验证。本研究证明核糖体蛋白RPL32-1和RPL32-2之间存在功能上的差异,它们能与不同的靶蛋白结合,行使某些特定的功能。这些结果对我们进一步研究RPL32-1和RPL32-2的功能具有重要意义。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
第一章 绪论  11-23
  一 酵母背景简介  11-12
    1 酵母的基因组的主要特征  11-12
    2 酵母作为模式生物的优势  12
  二 核糖体蛋白研究概况  12-16
    1 核糖体的研究历史及意义  12-14
    2 核糖体编码基因的表达与调控  14-15
      2.1 rDNA的转录与调控  14
      2.2 核糖体蛋白基因的表达及调控  14-15
    3 核糖体蛋白功能研究  15-16
  三 酵母细胞的凝絮以及相关的细胞表面蛋白  16-21
    1 凝絮的概念和分类  16-18
    2 无性絮凝的主要特征  18-20
      2.1 絮凝是由细胞表面的蛋白质造成的  18-19
      2.2 多种因素引起细胞絮凝  19-20
      2.3 絮凝由多种信号转导通路控制  20
    3 研究絮凝及相关的细胞壁蛋白的意义  20-21
  四 本论文的研究目的和主要研究内容  21-23
第二章 核糖体蛋白基因敲除引起的细胞絮凝的相关细胞壁蛋白的研究  23-43
  第一节 qRT-PCR分析部分细胞表面蛋白的表达情况  23-27
    1 材料与方法  23-26
      1.1 酵母细胞mRNA的提取和cDNA合成  23-24
      1.2 qRT-PCR引物的设计  24-25
      1.3 细胞壁表面蛋白的转录水平分析  25-26
    2 结果  26-27
      2.1 qRT-PCR产物特异性分析  26
      2.2 细胞壁表面蛋白的转录水平分析  26-27
    3 讨论  27
  第二节 过表达部分细胞表面蛋白对细胞絮凝影响的研究  27-35
    1 材料与方法  28-32
      1.1 实验材料  28
      1.2 粟酒裂殖酵母SP-Q01基因组的提取  28-29
      1.3 碱法小提质粒pREP3X  29
      1.4 细胞壁蛋白基因的克隆  29-30
      1.5 细胞壁蛋白的酵母表达质粒的构建  30
      1.6 过表达细胞壁蛋白基因的酵母菌株的构建  30-32
      1.7 过表达细胞壁蛋白基因的酵母菌株的形态观察  32
    2 结果  32-34
      2.1 酵母基因组提取  32
      2.2 细胞壁蛋白基因的克隆  32-33
      2.3 细胞壁蛋白基因的酵母表达质粒的构建  33-34
      2.4 过表达细胞壁蛋白基因的酵母菌株的形态观察  34
    3 讨论  34-35
  第三节 敲除部分细胞壁蛋白基因对细胞絮凝影响的研究  35-43
    1. 材料与方法  35-40
      1.1 实验材料  35
      1.2 敲除片段的构建  35-38
      1.3 敲除细胞壁蛋白基因的酵母菌株的构建  38-39
      1.4 敲除细胞壁蛋白基因的菌株的形态观察  39-40
    2 结果  40-41
      2.1 敲除细胞壁蛋白基因的酵母菌株的构建  40-41
      2.2 敲除细胞壁蛋白基因的菌株的形态观察  41
    3 讨论  41-43
第三章 S.Cerevisiae中核糖体蛋白基因的表达与细胞絮凝的关系的研究  43-60
  第一节 S.Cerevisiae核糖体蛋白基因的敲除及相关研究  43-50
    1 材料与方法  43-48
      1.1 实验材料  43
      1.2 敲除片段的构建  43-45
      1.3 敲除细胞壁蛋白基因的酵母菌株的构建  45-46
      1.4 敲除细胞壁蛋白基因的菌株的形态观察  46
      1.5 qRT-PCR分析rps26BΔ菌株核糖体蛋白基因表达情况  46-48
    2 结果  48-50
      2.1 敲除核糖体蛋白基因的酵母菌株的构建  48-49
      2.2 敲除核糖体蛋白基因的菌株的形态观察  49
      2.3 rps26BΔ菌株核糖体蛋白基因的转录水平分析  49-50
    3 讨论  50
  第二节 flo8回复突变以及RPG表达与细胞絮凝关系的研究  50-56
    1 材料与方法  50-54
      1.1 实验材料  50
      1.2 Overlap PCR构建flo8基因回复突变的融合片段  50-52
      1.3 flo8回复突变的酵母菌株的构建  52
      1.4 絮凝和非絮凝菌株的形态观察  52-53
      1.5 qRT-PCR分析絮凝和非絮凝菌株RPG表达情况  53-54
    2 结果  54-56
      2.1 flo8回复突变的酵母菌株的构建  54
      2.2 絮凝和非絮凝菌株的形态观察  54-55
      2.3 絮凝和非絮凝菌株核糖体蛋白基因表达分析  55-56
    3 讨论  56
  第三节 S.Cerevisiae的有性絮凝中核糖体基因表达分析  56-60
    1 材料与方法  56-58
      1.1 实验材料  56
      1.2 诱导不同交配型酵母细胞交配和形态观察  56-57
      1.3 有性絮凝时核糖体蛋白的转录水平分析  57-58
    2 结果  58-59
      2.1 诱导不同交配型酵母细胞交配和形态观察  58
      2.2 有性絮凝时核糖体蛋白的转录水平分析  58-59
    3 讨论  59-60
第四章 核糖体蛋白编码基因rpl32-1和rpl32-2的功能差异的研究  60-80
  第一节 过表达rpl32-1和rpl32-2对细胞的影响的研究  60-64
    1 材料与方法  60-61
      1.1 实验材料  60
      1.2 过表达rpl32-1和rpl32-2菌株生长特性研究  60-61
      1.3 通过流式细胞术检测细胞状态  61
      1.4 细胞热抗性差异分析  61
    2 结果  61-63
    3 讨论  63-64
  第二节 Co-IP筛选与RPL32-1和RPL32-2相作用的靶蛋白  64-73
    1 材料与方法  64-70
      1.1 实验材料  64
      1.2 RPL32蛋白的特异性抗体的纯化  64-67
      1.3 酵母细胞总蛋白的提取  67
      1.4 免疫共沉淀分离与RPL32-1和RPL32-2相结合的蛋白  67-68
      1.5 Western Blot检验Co-IP实验结果  68
      1.6 SDS-PAGE检测Co-IP产物  68-69
      1.7 Co-IP产物的分离和质谱鉴定  69-70
    2 结果  70-72
    3 讨论  72-73
  第三节 利用酵母双杂交验证RPL32与Grs1的相互作用  73-80
    1 材料与方法  74-76
      1.1 实验材料  74
      1.2 质粒pGBKT7/rpl32-1与rpl32-2,pGADT7/grs1的构建  74-75
      1.3 AD/Prey和BD/Bait质粒共转化AH109  75-76
    2 结果  76-78
      2.1 质粒 pGBKT7//p?2-J, pGBKT7/;p?2-2, pGADT7/pJ 的构建  76-78
      2.2 酵母双杂交结果  78
    3 讨论  78-80
全文总结  80-84
参考文献  84-97
附录一：本论文中所使用的菌株  97-98
附录二：主要试剂  98-99
附录三：主要仪器  99-100
致谢  100

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生物化学
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