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毕赤酵母表面展示CALB全细胞脂肪酶催化剂的发酵优化及其在天然维生素C改性中的应用

作　者: 徐娟
导　师: 阮晖
学　校: 浙江大学
专　业: 食品工程
关键词: 表面展示假丝酵母脂肪酶B 全细胞催化剂发酵冻干优化 L-抗坏血酸脂肪酸酯合成
分类号: TQ924
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

维生素C作为天然抗氧化剂备受青睐,但不具有脂溶性极大地限制了其应用。随着两步发酵生产技术的成熟,全球维生素C产能过剩危机严重。因此,维生素C改性对扩展其使用范围,增加其附加值,缓解产能过剩有重要的现实意义。对维生素C改性,生物法与化学法相比更具优势,但是目前生物酶制剂价格昂贵,制作繁琐。本论文对发酵法生产高效低成本的新型固定化生物催化剂—脂肪酶全细胞催化剂及其催化合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的工艺路线进行研究。首先对自主构建的毕赤酵母表面展示假丝酵母脂肪酶B (CALB)全细胞催化剂发酵、产酶关键条件进行优化。Invitrogen公司操作手册的基础上,优化后菌体富集BMGY培养基甘油含量为4%,装液量为25mL/250mL,转速为250r/min,发酵菌体密度OD600由优化前的24.68提高到55.4;诱导产酶BMMY培养基装液量为25mL/250mL,转速为250 r/min,甲醇的初始添加量为1%,每24h添加0.75%,诱导144h,单位发酵液的酶活力由优化前的11.7 U/mL升高到30.5U/mL。对毕赤酵母表面展示CALB全细胞催化剂的酶学特性进行研究。在催化对硝基苯酚棕榈酸酯的水解过程中,其最适反应pH是8,最适反应温度范围是40℃。同时,热稳定研究表明毕赤酵母表面展示CALB具有良好的稳定性,40℃恒温4h,仍能保持88%以上的水解活力。50℃恒温6h残存酶活仍在50%以上。L-抗坏血酸脂肪酸酯合成必须在非水相中进行,为获得干燥、催化酯合成效率高的毕赤酵母表面展示CALB全细胞催化剂,对其冻干条件进行优化。优化后的冻干条件为：pH为7.5的磷酸盐缓冲液进行pH“记忆”,油酸进行印迹,以5%脱脂乳/5%海藻糖(1:1)作为冻干保护剂进行冻干,酶活提高5倍左右。应用毕赤酵母表面展示CALB冻干粉在有机相中合成L-抗坏血酸脂肪酸酯。优化后的合成条件为：四氢呋喃作为反应介质,5 mL反应体系中加入L-抗坏血酸(100 mmol)和棕榈酸(L-抗坏血酸／棕榈酸=1:7),50 mg冻干全细胞催化剂,45℃, 100r/min下转化36h,反应6h时加入350 mg 4分子筛。优化后下,催化反应的转化率最高达到95.5%。

毕赤酵母表面展示CALB全细胞脂肪酶催化剂的发酵优化及其在天然维生素C改性中的应用

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