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小鼠孤啡肽基因的克隆及其原核表达

作　者: 刘国章
导　师: 杨国宇
学　校: 河南农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 小鼠 N/OFQ 克隆序列分析原核表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

孤啡肽（Nociceptin//Orphanin FQ,N/OFQ）作为一种内源性阿片肽类受体，属于G蛋白耦联受体，其在中枢和外周组织分布广泛。该基因在整个脑部区域有较高表达，可能在摄食及能量代谢过程中存在相应的调节作用，而且该基因的神经解剖学定位与能量平衡相关区域相一致。为进一步研究小鼠N/OFQ基因所编码蛋白质的生物学功能，本试验以昆明小鼠为研究对象，根据NCBI中公布的N/OFQ基因序列，设计其克隆引物，利用RT-PCR方法克隆小鼠N/OFQ基因，并构建其原核表达载体pET-28-N/OFQ，以浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导其蛋白表达，最后通过SDS-PAGE和Western blotting检测该蛋白。主要结果如下：1、小鼠N/OFQ基因的克隆及生物信息学分析从小鼠脑组织抽提总RNA，运用RT-PCR技术克隆了N/OFQ基因。克隆的鼠N/OFQ基因包含一个完整的ORF，长度为564bp，编码187个氨基酸，其中酸性氨基酸39个，碱性氨基酸29个，蛋白质分子量为：21.71kDa，等电点为：8.70。通过软件分析发现，其氨基酸序列与羊和牛的同源性最高，分别为98.3%和87.5%，与人、褐鼠、猕猴、貂、家兔和猪的同源性分别为83.3%、82.4%、85.2%、85.2%、78.4%和85.8%。系统进化分析显示其与褐鼠的亲缘关系最近，同在一枝上，与其他物种的亲缘关系相对较远。2、小鼠N/OFQ基因的原核表达为了获取N/OFQ的蛋白质分子，本试验根据克隆所得序列设计合成一对表达用引物，将小鼠N/OFQ的ORF片段亚克隆至原核表达载体pET-28a (+)中，经菌液PCR、双酶切及测序鉴定后，确定成功构建了N/OFQ基因的原核表达载体，将其命名为pET-28-N/OFQ。将成功构建的重组质粒pET-28-N/OFQ转化入大肠杆菌Rosetta中，以终浓度为1.0mmol/L的IPTG，于30℃条件下，诱导6h，诱导产物处理后，通过SDS-PAGE电泳和Western blotting进行验证。利用6×His Ni-NTA纯化柱纯化所得蛋白。经SDS-PAGE电泳显示，在相对分子量约20kDa处有单一目的条带，表明融合蛋白在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经Western blotting检测表明，获得的蛋白为目的蛋白N/OFQ。本研究成功克隆了小鼠N/OFQ基因，并构建其原核表达载体，通过原核表达得到了目的蛋白，为进一步研究小鼠N/OFQ基因的生物学功能奠定了试验基础。

全文目录

致谢  4-8
摘要  8-9
1 文献综述  9-16
  1.1 孤啡肽基因概述  9-10
    1.1.1 孤啡肽基因的发现  9
    1.1.2 孤啡肽的分子结构  9
    1.1.3 孤啡肽的分布  9-10
    1.1.4 孤啡肽与受体的结合特征  10
  1.2 孤啡肽受体  10
  1.3 孤啡肽的生物学功能  10-14
    1.3.1 孤啡肽与摄食及能量代谢的关系  10-11
    1.3.2 营养调控  11
    1.3.3 外源性 N/OFQ 对动物摄食的影响  11
    1.3.4 能量相互作用平衡途径  11-12
    1.3.5 孤啡肽的其他生物学功能  12-14
  1.4 孤啡肽及其受体与其他激素的相互作用关系  14
  1.5 展望  14-16
2 引言  16-17
3 材料与方法  17-33
  3.1 小鼠 N/OFQ 基因的克隆、序列分析与结构预测  17-26
    3.1.1 试验动物  17
    3.1.2 菌种与载体  17
    3.1.3 样品的采集  17-18
    3.1.4 主要仪器  18
    3.1.5 主要试剂  18-19
    3.1.6 试验常规试剂  19-22
    3.1.7 小鼠 N/OFQ 基因的克隆  22-25
    3.1.8 DNA 序列分析及蛋白结构预测  25-26
  3.2 小鼠 pET28α-N/OFQ 原核表达载体的构建  26-30
    3.2.1 重组表达质粒 pET28α-N/OFQ 的构建路线图  26
    3.2.2 目的基因质粒的获取  26-28
    3.2.3 原核表达载体 pET-28a (+)质粒的获取  28
    3.2.4 目的片断与表达载体 pET-28α（+）的酶切回收  28-29
    3.2.5 目的片段与表达载体的连接  29
    3.2.6 重组质粒的转化和筛选  29
    3.2.7 重组质粒 pET28a-N/OFQ 的鉴定  29-30
  3.3 小鼠 N/OFQ 基因在大肠杆菌中的表达  30-31
    3.3.1 重组质粒 pET-28α-N/OFQ 的表达鉴定  30-31
    3.3.2 重组质粒在原核细胞中的诱导表达  31
    3.3.3 融合表达产物的可溶性鉴定  31
  3.4 小鼠 N/OFQ 蛋白的纯化与 Western blot 鉴定  31-33
    3.4.1 重组蛋白 N/OFQ 的纯化  31-32
    3.4.2 Western blot 鉴定  32-33
4 结果与分析  33-45
  4.1 鼠 N/OFQ 基因克隆  33-38
    4.1.1 鼠 N/OFQ 基因的 RT-PCR 扩增  33-35
    4.1.2 鼠 N/OFQ 克隆序列分析  35-36
    4.1.3 核苷酸序列同源性分析  36-37
    4.1.4 氨基酸序列同源性分析  37-38
    4.1.5 N/OFQ 基因的系统进化分析  38
  4.2 .鼠 pET-28-N/OFQ 原核表达载体的构建  38-43
    4.2.1 N/OFQ 基因 PCR 扩增图（含酶切位点）  38-39
    4.2.2 带酶切位点基因 N/OFQ 菌液 PCR 电泳鉴定图  39
    4.2.3 质粒 pMD19-N/OFQ 和 pET-28 双酶切产物电泳图  39-40
    4.2.4 pET-28-N/OFQ 菌液 PCR 产物电泳结果  40-41
    4.2.5 重组质粒 pET-28-N/OFQ 双酶切鉴定结果  41
    4.2.6 重组质粒的测序鉴定  41-43
  4.3 小鼠 N/OFQ 基因在大肠杆菌中的表达  43-44
  4.4 N/OFQ 蛋白的纯化及 Western blot 鉴定  44-45
    4.4.1 融合蛋白的纯化  44-45
    4.4.2 Western blot 鉴定  45
5 讨论  45-46
6 结论  46-47
参考文献  47-51
英文摘要  51-53
附录：在研究生学习工作期间参与的其他科研工作  53

小鼠孤啡肽基因的克隆及其原核表达

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