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金黄色葡萄球菌表面多糖偶联抗原的制备及其免疫原性分析

作　者: 吴建勇
导　师: 王治才
学　校: 石河子大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎表面多糖分离纯化偶联抗原重组绿脓杆菌外蛋白A 免疫原性
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎以及医院临床感染的主要病原,对该菌感染的防治主要采用抗生素进行治疗。然而,长期、大量的抗生素应用导致细菌耐药性的增强和蔓延,使防治难度不断加大。此外,用抗生素治疗奶牛乳房炎还存在奶产品抗生素残留,影响食品安全。研制和开发有效疫苗,通过免疫接种进行金黄色葡萄球菌感染的预防已成为近年来研究的热点。表面多糖(CP5、CP8和336PS)是金黄色葡萄球菌的主要共同性抗原成分和毒力因子,也是疫苗开发的主要靶抗原。该类多糖的分子量小,免疫原性差,通过技术方法改善其免疫原性对于研制有效疫苗至关重要。本研究分别对金黄色葡萄球菌的3种重要表面多糖进行了提取、纯化、蛋白载体偶联和偶联抗原的免疫原性研究。首先采用高压破碎法使荚膜多糖CP5和CP8从金黄色葡萄球菌菌体释放,选用不同的酶处理去除破碎产物中的核酸和蛋白,再通过离子交换层析获得一定纯度的CP5、CP8荚膜多糖。表面多糖336PS的获取则采用溶葡萄球菌酶消化法使其从菌体释放,梯度乙醇浸提和不同酶的消化进行粗提,再通过凝胶层析纯化,得到了一定纯度的336PS多糖。研究建立了金黄色葡萄球菌表面多糖的化学检定方法。检测结果表明,CP5、CP8、336PS的纯度分别为67.51%、63.83%和68.51%；用免疫琼脂双扩散试验检测,纯化的多糖仅与抗同型菌株免疫血清发生沉淀反应。研究制备了3种表面多糖的蛋白偶联抗原,并对偶联抗原的免疫原性进行了检测。将纯化表面多糖通过ADH间桥法和EDAC零距离交联法与BSA偶联,凝胶过滤层析纯化,紫外扫描鉴定,从检定波长判定偶联成功。分别制备了6种表面多糖偶联抗原的油佐剂亚单位疫苗免疫小鼠,并以同样的方式制备3种未偶联表面多糖、PBS疫苗做对照。分别在免疫前,免疫第14d和第28d采集各组免疫小鼠血,分离血清,用间接ELISA检测血清中针对抗表面多糖的抗体水平。检测结果表明：2种偶联方法制备的抗原都能刺激机体产生抗良好的免疫应答反应,而未偶联的多糖则无免疫原性。为了解该抗体的的免疫保护性,在第28 d加强免疫一次,7天后后腿外侧注射同型菌株,观察小鼠后腿外侧临床病理变化并进行临床指数评分。攻毒实验表明,偶联抗原组能够对免疫小鼠提供较好的免疫保护作用。经综合分析,ADH间桥法制备的CP5-BSA、CP8-BSA和336PS-BSA偶联抗原免疫效果优于EDAC零距离交联法。为克服载体蛋白BSA在奶牛免疫中免疫原性差的问题,采用基因工程方法,通过PCR扩增绿脓杆菌外毒素A基因(ETA),构建重组表达载体pET-28a-ETA,转化进DH5a感受态细胞,提取重组质粒pET-28a-ETA并进行双酶切、PCR鉴定及测序鉴定。用IPTG进行诱导表达,对其产物进行SDS-PAGE和western blotting分析,并对诱导表达条件进行优化,确定目的蛋白分布,最终批量进行表达。采用尿素对包涵体进行变性并确定最佳的复性条件和复性缓冲液,Ni-NTA树脂柱上复性目的蛋白。柱上复性后目的蛋白的纯度达到93%以上。采用ADH间桥法制备了表面多糖-rEPA偶联,经过动物实验表明,以上三种多糖-rEPA偶联抗原均能刺激产生免疫应答反应。且分离血清能与同型菌株发生血清凝集反应,具有较好的免疫原性。该研究首次在国内建立了金黄色葡萄球菌表面多糖CP8、336PS的分离纯化和与载体蛋白的偶联技术方法,并通过小鼠免疫和攻毒证明了偶联抗原的免疫原性和免疫保护作用,为金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎亚单位疫苗的研制提供了技术储备。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-13
全文英语缩写  13-14
前言  14-16
第一章文献综述  16-27
  1 金黄色葡萄球菌表面多糖  16-19
    1.1 金黄色葡萄球菌荚膜多糖血清型分型  16-17
    1.2 表面多糖的表达与调控  17-19
    1.3 多糖的纯化  19
  2 表面多糖偶联抗原的制备  19-22
    2.1 偶联载体的选择  19-20
    2.3 偶联方法  20-21
    2.4 多糖-蛋白偶联抗原的鉴定  21-22
    2.5 现有偶联疫苗研究概况  22
  3 金黄色葡萄球菌感染的免疫与防治  22-27
    3.1 全菌疫苗  23
    3.2 亚单位疫苗  23-25
    3.3 病毒载体疫苗  25
    3.4 DNA疫苗  25
    3.5 基因缺失苗  25-27
第二章实验研究  27-78
  实验一 CP5、CP8和336PS表面多糖的提取与纯化  27-36
    1 实验材料  27-28
      1.1 主要仪器  27
      1.2 试剂  27
      1.3 菌株及抗血清  27-28
    2 实验方法  28-30
      2.1 金黄色葡萄球菌表面多糖的提取与纯化  28-29
      2.2 CP5、CP8和336PS的化学检定  29-30
      2.3 反应原性检测  30
    3 结果  30-33
    4 讨论  33-36
  实验二 CP5、CP8和336PS表面多糖与BSA偶联抗原的制备及其免疫原性研究  36-53
    1 实验材料  36-37
      1.1 主要仪器  36
      1.2 试剂  36
      1.3 主要溶液的配制  36-37
      1.4 实验动物  37
    2 实验方法  37-39
      2.1 pH值对多糖反应原性稳定性的检测  37
      2.2 CP5、CP8和336PS表面多糖-牛血清白蛋白偶联抗原的制备  37-38
      2.3 多糖-蛋白质偶联抗原的凝胶过滤层析纯化  38
      2.4 多糖-BSA偶联抗原的鉴定  38
      2.5 动物免疫试验  38
      2.6 间接ELISA对多糖抗体的测定  38-39
      2.7 小鼠攻毒保护实验  39
    3. 结果  39-50
    4. 讨论  50-53
  实验三基因工程技术制备绿脓杆菌外毒素A  53-71
    1 实验材料  53-55
      1.1 仪器设备  53
      1.2 菌种和质粒  53
      1.3 主要试剂  53-54
      1.4 溶液的配制  54-55
      1.5 引物  55
      1.6 抗绿脓杆菌血清  55
    2 实验方法  55-60
      2.1 绿脓杆菌外毒素A基因(ETA)的克隆  55-56
      2.2 重组表达载体的构建  56-57
      2.3 重组质粒的诱导表达及Western-blotting鉴定  57
      2.4 最佳诱导表达条件的选择  57-58
      2.5 rEPA的大量表达  58
      2.6 rEPA的变性与纯化  58-59
      2.7 rEPA的复性条件的筛选  59-60
      2.8 重组包涵体蛋白柱上复性  60
    3 结果  60-68
    4 讨论  68-71
  实验四 CP5、CP8、336PS与REPA偶联抗原制备及其免疫原性分析  71-78
    1 实验材料  71-72
      1.1 主要仪器  71
      1.2 试剂  71
      1.3 主要溶液的配制  71
      1.4 实验动物  71-72
    2 实验方法  72
      2.1 CP5、CP8和336PS表面多糖-rEPA偶联抗原的制备  72
      2.2 多糖-蛋白质偶联抗原的凝胶过滤层析纯化  72
      2.3 动物免疫试验  72
      2.4 清平板凝集实验  72
    3 结果  72-76
    4 讨论  76-78
第三章全文结论及创新点  78-80
  1 全文结论  78
  2 展望  78-79
  3 创新点  79-80
全文参考文献  80-89
附录  89-94
致谢  94-95
作者简介  95-96
导师评阅表  96

金黄色葡萄球菌表面多糖偶联抗原的制备及其免疫原性分析

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