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As_2O_3联合重组Canstatin蛋白对血管内皮细胞影响的研究

作　者: 傅文达
导　师: 王雪雯
学　校: 石河子大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: As2O3 Canstatin 人脐静脉内皮细胞肿瘤血管内皮细胞凋亡细胞迁移血管形成
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：通过重组canstatin蛋白、As203及二者联合方式分别干预人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和肿瘤血管内皮细胞(Td-EC),探讨干预因素对HUVEC和Td-EC生物学影响,为As203联合用药方案抗肿瘤的可行性和有效性提供实验基础和理论依据。方法：1.分别培养稳定转染pcDNA3.1-Canstatin-3Flag分泌型重组质粒肝癌HepG2细胞、HepG2细胞72h,提取上清液经超滤浓缩后,用Western-blot鉴定上清液中canstatin蛋白表达情况；2、HUVEC分离培养及鉴定。3.用肝癌HepG2细胞培养上清液培养HUVEC 72h,收集细胞,RT-PCR检测TEM1和TEM8的表达情况。4.实验按干预因素不同分重组组(稳定转染pcDNA3. 1-Canstatin-3Flag分泌型重组质粒的肝癌HepG2细胞培养上清液)、As203组(2μmol/L)、联合组(重组canstatin与As203蛋白)、空白组(HepG2细胞培养上清液),各因素分别干预HUVEC和Td-EC,通过绘制生长曲线、Transwell小室法、流式细胞术、内皮细胞成管实验等方法检测细胞生物学。结果：1.Western-blot检测重组质粒肝癌HepG2细胞培养上清液,可见大小约为26KD的Canstatin蛋白条带。2.培养的HUVEC经荧光免疫染色后,可见细胞质内有黄绿色荧光,表明人Ⅷ因子相关抗原存在;3.肝癌HepG2细胞培养上清液培养诱导HUVEC, RT-PCR扩增产物电泳显示约287 bp及460 bp的条带,提示细胞表达肿瘤血管内皮细胞标志物TEM1和TEM8,4.1.对细胞生长活力的影响：细胞每24h倒置显微镜下观察细胞生长情况、存活细胞计数,绘制细胞生长曲线；结果显示,HUVEC、Td-EC随培养时间延长,存活细胞数递减,呈时间依赖性,前后天存活细胞数比较p<0.05,实验组间比较p<0.05；重组组、As203组与对照组比较p<0.05,联合组与对照组比较p<0.01; Td-EC空白组存活细胞数增加比HUVEC空白组明显,二组间比较p<0.05; Td-EC实验各组存活细胞数减少比对应HUVEC实验各组明显,组间比较p<0.05。4.2对细胞凋亡的影响,凋亡率(HUVEC, Td-EC),重组组(12.2±0.32%,16.43±0.27%)、As203组(9.76±0.17%,14.05±0.21%)和联合组(15.78±0.18%,20.69±0.23%),空白组(6.30±0.13%,4.73±0.14%),单一用药组间比较p<0.05,联合组分别与单一用药组比较p<0.01,实验各组与空白组比较p<0.01; Td-EC各组与对应的HUVEC各组比较p<0.05,空白组之间比较p<0.05。4.3对细胞迁移、管腔能力的影响,迁移细胞数(HUVEC, Td-EC),重组组(29.20±1.30,27.60±0.55)、As203组(36.00±1.00,33.20±1.30)、联合组(24.33±1.36,21.00±1.26)、空白组(45.40±1.14,50.60±1.34)；管腔形成数(HUVEC, Td-EC)分别为,重组组(4.40±1.03,3.50±0.94)、As203组(6.00±1.14,4.96±0.93)、联合组(2.90±0.92,2.30±0.75),空白组(13.23±0.89,14.13±1.28),其中联合组迁移细胞数、管腔形成数最少,三组间比较p<0.05；实验各组与空白组比较p<0.01; Td-EC各组与对应的HUVEC各组比较p<0.05,两细胞空白组比较p<0.05。结论：1.稳定转染重组质粒的肝癌HepG2细胞培养上清液中有表达Canstatin蛋白.2. HUVEC经诱导鉴定为Td-EC.3. Td-EC比HUVEC具有更强细胞成活能力、血管形成能力及迁移能力。4.三个干预因素对内皮细胞有促进凋亡作用和抑制细胞成活能力、血管形成、迁移能力,并以联合组作用最强,同时Td-EC对上述作用的敏感性高于HUVEC.

As_2O_3联合重组Canstatin蛋白对血管内皮细胞影响的研究

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