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Beclin1基因增强三阴性乳腺癌细胞BT-549对多柔比星的敏感性

作　者: 王日玮
导　师: 吴爱国
学　校: 南方医科大学
专　业: 普通外科学
关键词: Beclin1基因自噬凋亡 BT-549细胞多柔比星
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年约有130万人被诊断为乳腺癌,约40万人死于该病。随着生活环境、生活方式和膳食结构的改变,世界各地乳腺癌的发病率明显上升,并呈年轻化的趋势。在我国过去的十年中,乳腺癌发病率上升了27%,其中40%的患者在5年内的死亡率呈现出接近西方的态势。在京津沪等大城市,乳腺癌患病率已居女性恶性肿瘤之首。乳腺癌业已成为威胁妇女生命和健康的头号杀手。随着现代分子生物学技术的不断发展,对乳腺癌的认识变得越来越深入：乳腺癌是一种生物学特征高度异质性的恶性肿瘤,根据组织学、免疫组化及分子生物学技术可将其分为不同的亚型。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer TNBC)是指ER、PR、Her-2都为阴性的乳腺癌,约占所有乳腺癌类型的10-17%左右。随着对TNBC的了解不断深入,现已明确其生物学特性有别于其它类型的乳腺癌。目前对TNBC的研究多从basal-like乳腺癌入手,原因在于多数TNBC具有basal-like乳腺癌表现：侵袭性强,淋巴细胞多呈阳性,核分裂相等级高,有丝分裂计数多,肿瘤细胞坏死,肿瘤中间形成硬化灶等。学者Nielsen利用免疫组化研究发现：basal-like乳腺癌中ER、Her-2阴性,但表达细胞角蛋白(cytokeratin)、CK5/6及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor EGFR)。CK5/6为表达于正常基底或者肌上皮乳腺组织的高分子量细胞角蛋白,被认为是鉴定basal-like乳腺癌最有效的标志。basal-like乳腺癌其它的生物学标志还有CK14,CK17,p53,平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin), c-kit、钙联蛋白(P-cadherin)等。一些研究显示,至少有25%的TNBC发生BRCA1的有害突变,而其它类型的乳腺癌只有2%发生BRCA1突变,这些研究证据表明了BRCA1突变与TNBC之间的关联。虽然大多数basal-like乳腺癌是TNBC,但不能笼统认为两者是一种类型,因为basal-like乳腺癌有时候会表达ER、PR或Her-2,且TNBC有时也不会表达基底样标志。目前TNBC的治疗策略主要有：化疗、放疗、基因治疗及靶向药物治疗。继续探索TNBC的治疗方法将是乳腺癌研究的一个重点方向。TNBC中多种肿瘤抑制因子缺失,其中包括Beclinl基因。Beclinl基因包含12个外显子,长度从61至794bp；内含子长度从106bp至2kbp。完整的Beclinl基因序列编码2098bp转录子,包含120-bp5’UTR,1353-bp编码区和625-bp3’UTR,其mRNA编码60kDa大小的蛋白,此蛋白能与凋亡抑制剂Bcl-2相互作用。Beclinl含Bcl-2同源区(BH3),卷曲螺旋区(CCD)及进化保守区(ECD),这些区域能够结合不同的蛋白。通过ECD, Beclinl能结合磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),Vps34,从而募集更多的Atg蛋白,调节自噬溶酶体的形成。通过BH3, Beclinl能结合Bcl-2/Bcl-XL,从而形成Bcl-2/Bcl-XL-Beclinl复合物(Bcl-2通过抑制凋亡的诱导而促进细胞的生存,其在多种肿瘤中过表达),从而调节细胞凋亡。基于此,Beclinl基因可双重调节细胞自噬及凋亡。哺乳类细胞过表达Beclinl基因时,能调节细胞自噬。自噬可通过与凋亡不同的降解机制(膜泡降解)和分子机制(特定基因的激活),使细胞程序性死亡,可作为第二种程序性细胞死亡。当前多从自噬角度探讨Beclinl基因与各种肿瘤的关系,其在多种人类癌症中表达下调,包括75%的卵巢癌,50%的乳腺癌、40%的前列腺癌、结直肠癌等。学者Liang利用Western blot技术分析了乳腺癌来源的细胞系、正常乳腺组织及来源于侵袭性散发乳腺癌的组织。分析了11种乳腺癌细胞系,其中只有3种乳腺癌细胞发现了Beclinl基因。在17例正常乳腺组织及对照的乳腺癌组织中,15例正常组织检测到了高水平的Beclin1基因表达,远远高于癌组织。而与之相反的是,16例癌组织中发现了对照蛋白的高表达,而正常组织则无如此表现,Beclin1在乳腺癌中表达下调。从凋亡角度研究Beclin1基因与肿瘤的关系较少。学者Furuya发现人类胃癌细胞MKN28过表达Beclin1能够促进顺铂诱导的癌细胞凋亡,用RNA干扰技术沉默MKN1细胞系中Beclin1基因的表达,则能减轻细胞毒性,与此同时,caspase-9活性的增加。因此,Beclin1通过caspase-9来促进顺铂诱导的胃癌细胞凋亡。他们的研究表明Beclin1可作为一个促凋亡分子。Beclin1能够促进乳腺癌细胞的自噬,然而,Beclin1作为促凋亡分子的作用仍然不明确,特别是在TNBC中。基于以上认识,探索Beclin1基因与TNBC的关系,将为TNBC的治疗带来新的策略。目的：自噬基因Beclin1的缺失与多种肿瘤的发生有关,包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等。当前的研究表明Beclin1基因调节细胞自噬,自噬通过限制染色体的不稳定性,阻止致癌突变的累积；减轻低氧应激以及减少瘤内的坏死和炎症来对抗癌变,使肿瘤细胞程序性死亡(有别于凋亡)。但对于Beclin1基因的促凋亡作用研究很少(目前能够检索到的相关文献只有：Beclin1基因能够通过caspase-9促进化疗药物顺铂及多柔比星诱导的癌细胞凋亡)。对于Beclin1基因能否促进三阴性乳腺癌细胞的凋亡暂未见报道。因此本研究旨在探讨三阴性乳腺癌细胞BT-59中Beclin1基因过表达对癌细胞增殖,以及Beclin1基因对多柔比星环境下生长的BT-549细胞的影响。方法：(1)检测多柔比星对BT-549细胞的半抑制浓度：设置5个不同的多柔比星浓度,向正常环境下生长的BT-549细胞中加入各个浓度的多柔比星5μl,利用MTT方法测量每个浓度下的光密度值,然后计算半抑制浓度；(2)利用脂质体法将pDsRed-C1-Beclin1质粒转染人三阴性乳腺癌BT-549细胞系,转染空载质粒pDsRed-C1作为对照组；(3)本实验细胞分为3组：①空白组：只接种细胞,不做任何处理；②阴性对照组：将空载质粒pDsRed-C1转染人三阴性乳腺癌BT-549细胞株；③Beclinl组：将目的质粒pDsRed-Cl-Beclinl转染人三阴性乳腺癌BT-549细胞株。每组细胞的生长环境分为正常环境及多柔比星处理下的环境(于转染后4-6h加多柔比星处理)；(4)吖啶橙(AO)染色检测正常生长环境下BT-549细胞自噬的变化：细胞接种于6孔板中,待细胞长至60-80%融合度后,脂质体法转染转染细胞,转染后的细胞继续培养于含10%胎牛血清的1640培养液中72h。弃去各组培养液,予PBS洗涤细胞两次后,于避光环境下加入0.1g/L吖啶橙溶液两滴染色,并于37℃培养箱中避光孵育15min后显微镜下观察染色情况；(5)MTT法分析外源性Beclinl基因过表达对两种环境下生长的BT-549细胞增殖影响：细胞接种于96孔板,待细胞长至60%-80%融合后进行细胞转染,转染后细胞继续培养于10%FBS的1640培养液内,分别于不同时间点向各样本内加入MTT溶液(浓度5mg/ml)20μ1,吸去上清后,每孔加入150μ1DMSO,充分混匀后于多功能酶标仪上检测各组细胞490nm的光密度值；(6) RT-PCR法检测两种环境下各组细胞Beclinl mRNA的表达：细胞接种于6孔板中,待细胞长至80%融合度后,脂质体法转染细胞,转染后的细胞继续培养于含10%胎牛血清的1640培养液中72h。收集各组细胞RNA,测定浓度后进行逆转录及扩增,扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳,电泳完毕后将胶置入凝胶成相系统中观察；(7) Western blot法检测两种环境下各组细胞蛋白的表达；细胞接种于6孔板,转染完毕后继续用全培培养72h,收集各组细胞中的蛋白(多柔比星环境下生长的细胞,培养液中的细胞蛋白也要收集),测定各组蛋白浓度后进行电泳、转膜、封闭,然后加入一抗及二抗显色,并在显影仪上观察显色结果；(8)流式细胞仪检测两种环境下BT-549细胞凋亡及周期情况：BT-549细胞接种于6孔板,细胞转染后继续培养72h。胰酶消化细胞后,离心收集各组细胞,弃去上清,避光环境下向各样品中加入Binding Buffer重悬细胞,依次加入AnnexinV-FITC和PI,将各样品置于冰上,于1小时内在流式细胞仪上检测凋亡。用EP管离心收集6孔板中的各组细胞,每组加入70%的乙醇于-20℃下固定过夜,取出乙醇固定过的细胞,离心去上清,冷PBS洗2遍。加入400μ1的PBS,40μ1的RNA酶室温孵育30min,再加入60μl的PI染色,4℃孵育30min,于流式细胞仪上检测周期。(9)统计学方法：细胞增殖采用重复测量方差分析方法；其余组间差异显著性用one-way ANOVA方法分析;方差齐性用Levene检验：满足方差齐性用LSD检验；不满足方差齐性用Dunnett’T3检验。显著性水准a=0.05。结果：(1)正常生长环境及多柔比星处理后,真核表达质粒pDsRed-Cl-Beclinl明显促进BT-549细胞Beclinl mRNA及蛋白的表达。多柔比星处理前各组细胞Beclinl mRNA表达情况：Beclinl组相对灰度值为(0.70±±0.03),高于阴性对照组(0.34±0.04)及空白组(0.32±0.07)。多柔比星处理后各组细胞Beclinl mRNA表达情况：Beclinl组mRNA的相对灰度值为(0.76±0.07),亦高于(0.33±0.05)及空白组(0.29±0.05)；(2)经MTT法测得多柔比星对BT-549细胞的半抑制浓度为1.4μg/ml;(3)多柔比星处理前,各组细胞增殖曲线呈上升型,但Beclinl组较另外两组平缓的多[各组细胞96h的OD值为：Beclinl组(1.73±0.27),阴性对照组(2.65±0.32)及空白组(2.71±0.22)。各P<0.05],Beclinl基因抑制了BT-549细胞的增殖；多柔比星处理后,各组细胞增殖曲线呈下降趋势,但Beclinl组下降更快[96h的OD值为：Beclinl组(0.08±.05),阴性对照组(0.35±±0.14)及空白组(0.41±0.08)。各P<0.05]；(4)多柔比星处理前各组细胞凋亡率为:Beclinl组(8.81±±1.45)%,明显高于阴性对照组(3.06±0.31)%及空白组(2.87±0.18)%(P<0.05),Beclinl基因能促进BT-549细胞凋亡；多柔比星处理后各组细胞凋亡率为：Beclinl组(14.3±1.09)%,阴性对照组(4.81±0.7)及空白组(4.58±0.7)%(P<0.05),同样的条件下,转染pDsRed-C1-Beclinl的细胞凋亡率更高,因此,Beclinl基因能增强BT-549细胞对多柔比星的敏感性；(5)细胞周期分析显示,无论多柔比星处理与否,转染pDsRed-C1-Beclinl质粒,处于G1期的BT-549细胞明显高于另外两组细胞,Beclinl基因能抑制的BT-549细胞的有丝分裂；(6)正常环境下,AO染色观察到了转染pDsRed-C1-Beclinl的细胞中有红色斑点的酸性膜泡的出现,而另外两组则无此现象,表明Beclin基因可促进细胞自噬。结论：(1)吖啶橙染色中,转染pDsRed-C1-Beclinl的细胞出现嗜酸性红色膜泡,因此Beclinl基因能调控BT-549细胞的自噬；(2)三阴性乳腺癌细胞BT-549过表达Beclinl基因,可抑制癌细胞增殖,促进癌细胞凋亡；(3)多柔比星处理转染后的各组BT-549细胞,转染pDsRed-C1-Beclinl的细胞增殖曲线下降趋势更快；凋亡率更高,因此,Beclinl基因提高了三阴性乳腺癌细胞BT-549对化疗药物多柔比星的敏感性；(4)本实验提示Beclinl基因不仅可作为自噬调节因子,还可作为促凋亡分子。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-19
第一章前言  19-27
  参考文献  23-27
第二章 Beclin1基因增强三阴性乳腺癌细胞BT-549对多柔比星的敏感性  27-60
  第一节实验材料与试剂  27-31
  第二节实验方法  31-44
  第三节实验结果  44-50
  第四节讨论  50-56
  第五节结论  56-57
  第六节参考文献  57-60
附录  60-62
综述  62-74
  参考文献  70-74
攻读学位期间成果  74-75
致谢  75-76

Beclin1基因增强三阴性乳腺癌细胞BT-549对多柔比星的敏感性

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