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基因C9orf100及STC2在肝癌发生发展中的作用及其机制的探讨

作　者: 王海啸
导　师: 蔡兵
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: 肝癌 C9orf100 STC2 细胞周期 细胞凋亡
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


本论文研究内容包括两方面：第一部分探讨DBL家族中核苷酸交换因子(GEFs)的新成员C9orf100基因在肝癌细胞发生以及发展过程中的作用及机制的初步探讨。本实验室利用高通量组学技术对肝癌样本进行基因表达谱分析,发现基因C9orf100在22例肝癌病人样本中全部表达上调,通过对标本目的基因PCR的实验结果验证了基因芯片的结果。在44对肝癌标本中,发现其中42对标本的癌组织C9orf100的表达量明显高于癌旁(T/N≥2)。与临床资料的关联性分析中发现,C9orf100的表达量与肝癌在肝内转移灶的数量和血清中AFP的表达量、患者肝硬化程度成正相关。此外,免疫荧光实验证实C9orf100蛋白定位于细胞膜或靠近胞膜。进一步细胞实验发现人工过表达C9orf100能够促进肝癌细胞的增殖。相反,人工合成siRNA干扰C9orf100表达后,能够抑制肝癌细胞的生长。同时,流式细胞仪检测证实C9orf100表达下降后,细胞周期阻滞在G2/M期、促进细胞凋亡。最后,以Huh7细胞作为细胞模型,人工过表达C9orf100发现AKT的活性增加；相反,在MHCC-97H细胞中发现基因沉默C9orf100表达后,AKT的活性显著下降。我们的最新研究结果表明C9orf100能够通过调控细胞周期分布和凋亡来影响肝癌细胞的增殖以及在细胞转移着方面发挥重要的作用。第二部分斯钙素2(stanniocalcin,STC2)作为斯钙素蛋白家族成员中的员,已被报道参与了一些肿瘤的形成,本课题研究发现与癌旁组织相比,STC2基因在79.5%(35/44)肝癌组织中的表达量明显上调；沉默肝癌细胞株中内源性STC2基因表达后.肝癌细胞的生长、克隆形成能力明显降低,,细胞转移能力也明显下降,而过表达STC2基因后,对肝癌细胞生长和转移作用则正好相反；进而,通过流式细胞术证实人工干扰STC2表达后,肝癌细胞周期阻滞在G0/G1期。蛋白免疫印迹实验进一步证实了蛋白cyclin D1和pERK1/2在STC2调控细胞周期的过程中发挥着重要作用。结果指出,基因STC2在肝癌形成过程中发挥着致癌的作用。

全文目录


中文摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词表  11-12
第一部分 C90RF100在肝癌发生发展中的作用及机制的研制  12-52
  前言  12-16
  第一章 C9orf100在肝癌样本及细胞株中的表达差异  16-29
    1.1 材料与方法  16-22
      1.1.1 临床组织样本的获取  16
      1.1.2 细胞培养  16-17
      1.1.3 细胞RNA抽提及逆转录  17-18
      1.1.4 半定量及定量PCR  18-20
      1.1.5 细胞免疫荧光  20-22
      1.1.6 统计学分析  22
    1.2 结果  22-26
      1.2.1 C9orf100基因在肝癌组织中的表达分析  22-24
      1.2.2 C9orf100基因在肝癌细胞株和不同人体正常组织中的表达分析  24-25
      1.2.3 C9orf100蛋白在肝癌细胞中的亚细胞定位  25-26
    1.3 讨论  26-28
    1.4 小结  28-29
  第二章 C9orf100可以促进肝癌细胞的增殖和转移  29-46
    2.1 材料与方法  29-38
      2.1.1 C9orf100的siRNA的设计和合成  29-30
      2.1.2 siRNA转染及干扰效率的评价  30-31
      2.1.3 C9orf100真核表达载体构建  31-34
      2.1.4 pcDNA3.1(-)B-FLAG-hrGFP-C9orf100质粒的转染  34-35
      2.1.5 细胞蛋白提取和蛋白免疫印迹技术(Western Blot)  35-36
      2.1.6 CCK8检测细胞的生长  36-37
      2.1.7 细胞克隆形成实验  37
      2.1.8 细胞迁移能力测定  37-38
      2.1.9 统计分析  38
    2.2 结果  38-44
      2.2.1 内源性C9orf100基因表达下调抑制肝癌细胞增殖  38-39
      2.2.2 过表达C9orf100基因促进肝癌细胞生长  39-40
      2.2.3 过表达C9orf100基因促进肝癌细胞克隆形成  40-41
      2.2.4 过表达C9orf100基因促进肝癌细胞迁移  41-43
      2.2.5 C9orf100基因的表达下调能够抑制肝癌细胞迁移能力  43-44
    2.3 讨论  44-45
    2.4 结论  45-46
  第三章 C9orf100促进肝癌细胞增殖机制的初步探讨  46-51
    3.1 材料与方法  46-47
      3.1.1 流式细胞仪分析细胞周期  46-47
      3.1.2 流式细胞仪分析细胞凋亡  47
      3.1.3 蛋白免疫印迹  47
    3.2 结果  47-50
      3.2.1 C9orf100基因的表达下调能够诱导MHCC-97H细胞的G_2/M期阻滞和S期细胞减少  47-48
      3.2.2 C9orf100基因的表达下调能够诱导MHCC-97H细胞凋亡  48-49
      3.2.3 蛋白C9orf100正向调控蛋白AKT的磷酸化  49-50
    3.3 讨论  50-51
    3.4 结论  51
  总结  51-52
第二部分 STC2在肝癌形成中发挥致癌作用及机制的研究  52-74
  前言  52-53
  第一章 STC2在肝癌样本及细胞株中的表达规律  53-60
    1.1 材料与方法  53-55
      1.1.1 临床组织样本的获取  53
      1.1.2 细胞培养  53-54
      1.1.3 细胞RNA抽提及逆转录  54
      1.1.4 半定量及定量PCR  54
      1.1.5 组织和细胞蛋白的提取  54-55
      1.1.6 细胞蛋白提取和蛋白免疫印迹技术(Western Blot)  55
      1.1.7 统计学分析  55
    1.2 结果  55-58
      1.2.1 STC2在肝癌组织中的表达差异  55-58
      1.2.2 STC2在肝癌细胞株中的表达水平  58
    1.3 讨论  58-59
    1.4 小结  59-60
  第二章 STC2可以促进肝癌细胞的生长和转移  60-70
    2.1 材料与方法  60-64
      2.1.1 STC2的siRNA的设计和合成  60
      2.1.2 siRNA转染及干扰效率的评价  60
      2.1.3 STC2真核表达载体构建  60-61
      2.1.4 pSUPER-shRNA质粒的构建  61-63
      2.1.5 质粒的转染  63-64
      2.1.6 细胞蛋白提取和蛋白免疫印迹技术(Western Blot)  64
      2.1.7 CCK8检测细胞的生长  64
      2.1.8 细胞迁移能力测定  64
      2.1.9 统计分析  64
    2.2 结果  64-68
      2.2.1 STC2基因表达下调抑制肝癌细胞增殖  64-65
      2.2.2 稳定干扰STC2基因表达抑制肝癌细胞克隆形成  65-66
      2.2.3 过表达C9orf100基因促进肝癌细胞生长和克隆形成  66-67
      2.2.4 STC2基因表达的变化对肝癌细胞迁移能力的影响  67-68
    2.3 讨论  68-69
    2.4 结论  69-70
  第三章 STC2在肝癌发生发展中发挥致癌作用机制的初步探讨  70-73
    3.1 材料与方法  70
      3.1.1 流式细胞仪分析细胞周期  70
      3.1.2 蛋白免疫印迹  70
    3.2 结果  70-72
      3.2.1 基因沉默STC2表达引起MHCC-97H和MHCC-97L细胞的G_0/G_1期阻滞和S期减少  70-71
      3.2.2 蛋白STC2的表达量变化对细胞周期相关调控蛋白P53、CyclinD1的表达水平和ERK1/2磷酸化水平的影响  71-72
    3.3 讨论  72-73
    3.4 结论  73
  总结  73-74
参考文献  74-79
综述  79-87
  参考文献  84-87
硕士研究生期间所发表文章  87-88
致谢  88

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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