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脐带间充质干细胞对肝癌细胞株HepG2增殖影响的实验研究

作　者: 沙凤
导　师: 杨晋辉
学　校:
专　业: 消化内科
关键词: 脐带间充质干细胞 HepG2细胞 共培养 凋亡 增殖
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


研究目的：1、探索脐带间充质干细胞(UC-MSCs)培养的最佳密度,研究其生物学特性及表型特征。2、研究脐带间充质干细胞(UC-MSCs)对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的作用及其可能的机制。研究方法：1、复苏第3代(passage3, P3)脐带间充质干细胞(UC-MSCs),于含10%胎牛血清的DMEM/F12中培养,传代至P7,将P3和P7进行表型鉴定,比较两者间差别,取第7代进行共培养实验。2、计数脐带间充质干细胞(UC-MSCs),分别以8×106/孔、4×106/孔、2×106/孔、1×106/孔、5×105/孔、2.5×105/孔进行培养,观察比较细胞生长情况,取相应适合密度进行共培养实验。3、消化收集脐带间充质干细胞(UC-MSCs),分别取4×106/孔、2×106/孔、1×106/孔、5×105/孔、2.5×105/孔种于六孔板,24h后于上层Transwell膜种1×106/孔肝癌HepG2细胞,共培养24h、48h、72h后Tunell法检测肝癌HepG2细胞凋亡,流式细胞仪检测肝癌HepG2细胞内蛋白AFP、Bcl2、Survivin的表达,另分别取1.5×106/孔、1.25×106/孔、1×106/孔、7.5×105/孔、5×105/孔种于六孔板,24h后于上层Transwell膜种,5×105/孔肝癌HepG2细胞,共培养24h、48h、72h后MTT检测细胞增殖。4、消化收集脐带间充质干细胞(UC-MSCs),取1.5×106/孔、1.25×106/孔、1×106/孔、7.5×105/孔、5×105/孔种于六孔板,24h后于上层Transwell膜种,5×105/孔肝癌HepG2细胞,共培养72h后RT-PCR检测AFP、Bcl2、Survivn基因表达。结果：1、脐带间充质干细胞(UC-MSCs)经冻存后复苏,细胞呈平行排列或漩涡状生长,形态均一。2、P3及P7细胞免疫表型显示表达间充质干细胞标记CD29. CD44、 CD90、 CD105,不表达造血干细胞表面标记CD34、 CD45。3、不同密度的脐带间充质干细胞(UC-MSCs)培养及结果显示：8×106/孔、4×106/孔细胞24h即完全长满,且细胞可见贴壁细胞密度较大,不能完全伸展,而8×106/孔可见大量细胞不能贴壁。2×106/孔、1×106/孔、5×]05/孔、2.5×105/孔细胞24h即贴壁完全,且完全伸展,状态良好,但尚未长满6孔板,72h后8×106/孔、4×106/孔、2×106/孔细胞可完全长满6孔板,除见8×106/孔未贴壁细胞死亡,其余密度孔细胞未见细胞死亡,所有细胞随培养时间的增加体积增大,细胞排列逐渐有序。4、共培养后HepG2细胞凋亡率随脐带间充质干细胞(UC-MSCs)密度的增加而增加,差异有统计学意义(P<0.01),随UC-MSCs作用时间的延长而增加,差异有统计学意义(P<0.01),72h凋亡率达53.4%。5、共培养后肝癌HepG2细胞内蛋白AFP、 Bc12、 Survivn的阳性表达率随脐带间充质干细胞(UC-MSCs)密度的增加而降低,差异有统计学意义(P<0.01),随时间的延长而降低,除对照组差异无统计学意义外(P>0.05),其余各个密度组差异均有统计学意义(P<0.01)。6、共培养后HepG2细胞增殖抑制率随UC-MSCs作用密度增加而增加,随作用时间延长而增加,差异有统计学意义(P<0.01)。7、共培养后HepG2细胞内AFP、 Bcl2、 Survivn基因表达随UC-MSCs作用密度增加而增加而减少,差异有统计学意义(P<0.01)。结论：脐带间充质干细胞(UC-MSCs)与肝癌HepG2细胞共培养后可促进肝癌HepG2细胞凋亡,抑制HepG2细胞增殖,该作用与肝癌HepG2细胞内凋亡蛋白AFP、 Bc12、 Survivn目关。

全文目录


英文縮写  6-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-12
前言  12-14
材料  14-16
方法  16-23
  3.1 细胞培养  16
  3.2 细胞传代  16
  3.3 细胞冻存  16-17
  3.4 细胞复苏  17
  3.5 共培养  17-18
  3.6 UC-MSCs表面标记的检测  18
  3.7 流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡  18-19
  3.8 流式细胞仪检测HepG2细胞内AFP、Bcl2、Survivin蛋白表达  19
  3.9 MTT检测HepG2细胞增殖  19
  3.10 RT-PCR检测HepG2细胞内AFP、Bc2、Survivin基因表达  19-22
  3.11 统计分析  22-23
结果  23-47
  4.1 冻存及传代对UC-MSCs及HepG2细胞的影响  23
  4.2 流式细胞仪检测UC-MSCs表面标记结果  23-25
  4.3 不同密度UC-MSCs培养结果  25
  4.4 共培养结果  25-28
  4.5 UC-MSCs诱导HepG2细胞凋亡的检测结果  28-31
  4.6 共培养后HepG2细胞内蛋白AFP表达情况  31-35
  4.7 共培养后HepG2细胞内蛋白Bc2表达情况  35-39
  4.8 共培养后HepG2细胞内蛋白Survivin表达情况  39-43
  4.9 共培养后UC-MSCs对HepG2细胞的抑制效应  43-44
  4.10 RT-PCR检测HepG2细胞内AFP、Bcl2、Survivin基因表达情况  44-47
    4.10.1 HepG2细胞内总RNA提取结果  44-45
    4.10.2 RT-PCR扩增结果  45-46
    4.10.3 各基因表达情况  46-47
讨论  47-53
结论  53-54
参考文献  54-60
文献综述  60-71
  参考文献  68-71
攻读学位期间发表文章情况  71-72
致谢  72

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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