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SMP30在肝细胞癌发展过程中的作用机制研究

作　者: 张胜昌
导　师: 周素芳
学　校: 广西医科大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: SMP30 肝癌 Hep G2 非经典途径分泌蛋白 DNA甲基化 siRNA 细胞增殖侵袭能力细胞凋亡 Bax/Bcl-2 细胞周期
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：1、观察细胞传代对SMP30蛋白表达变化的影响,并验证SMP30是否为分泌蛋白。2、检测SMP30蛋白在肝细胞癌发生发展过程中的表达水平变化趋势,判断其表达水平变化是否与肝细胞癌发展病程有关。3、从DNA甲基化和siRNA的角度探讨SMP30在肝细胞癌发展中的表达变化机制。4、初步探讨SMP30对肝癌细胞生物学特性(增殖、凋亡、侵袭以及细胞周期)的影响。方法：1、用生物信息学方法预测SMP30的分泌特性；用高糖DMEM培养基培养Hep G2细胞株,从第2代开始每隔1代收集培养细胞,提取细胞总蛋白；同时分别提取Hep G2细胞的细胞膜蛋白、细胞浆蛋白和细胞核蛋白,收集细胞培养液上清,超滤离心管浓缩,蛋白质印迹法检测SMP30蛋白的含量。2、用注射器将人肝癌Hep G2细胞注入裸鼠腋部皮下制作裸鼠种植瘤模型,将荷瘤裸鼠按取材时间不同分为2周组、4周组、6周组,每组10只,并取10只无荷瘤裸鼠作为对照组。根据分组情况分别取材,经眼眶静脉丛取血后处死裸鼠,分离血清,Western-blot法测裸鼠血清SMP30蛋白含量；剥离瘤组织,一部分做成蜡块,用免疫荧光组织化学法检测瘤组织内SMP30蛋白的表达情况。一部分以-80℃冰箱冻存,用来提取总RNA和基因组DNA,用提取的总RNA进行逆转录,做荧光定量PCR,检测SMP30mRNA含量；提取的基因组DNA用亚硫酸氢盐进行修饰,做甲基化特异性PCR(MSP),检测SMP30基因启动子甲基化的情况。3、收集广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科2012年2月至2012年7月外科手术切除的新鲜肝癌组织标本、癌旁组织及距肿瘤边缘5cm以上的正常肝组织各40例,提取总RNA进行逆转录,做荧光定量PCR,检测SMP30mRNA含量；提取的基因组DNA用亚硫酸氢盐进行修饰,做甲基化特异性PCR(MSP),判断DNA甲基化和SMP30蛋白表达及AFP的相关性。4、设计3条siRNA及1条对照序列交上海吉玛公司合成,转染Hep G2细胞,利用荧光定量PCR测各组siRNA对SMP30mRNA的干扰效率,Western-blot法检测各组siRNA对SMP30蛋白的干扰效率,筛选出干扰效率最好的序列。用MTT法检测细胞增殖情况；用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western-blot法检测凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2;用Transwell、室检测Hep G2细胞的侵袭能力；用流式细胞仪检测细胞周期变化。结果：1、用生物信息学软件Secretome2.0预测SMP30分泌性,其NN值为0.544,说明其可能是非经典途径分泌蛋白。2、Hep G2细胞在传代过程中SMP30蛋白含量无明显变化；细胞浆和细胞核中SMP30蛋白含量也无明显变化；无统计学意义差异(均P>0.05)。对细胞培养液上清进行Western blot检测,发现有相当数量的SMP30蛋白。3、接种于裸小鼠皮下的Hep G2细胞均成瘤(30/30),病理切片显示符合肝细胞性肝癌特征,肿瘤分化程度中等。免疫荧光结果显示,2周组瘤组织内SMP30蛋白表达量高于4周组和6周组,差异均有统计学意义(均P<0.01),4周组和6周组无差异。4、对裸鼠血清进行Western blot检测,发现各时间组荷瘤裸鼠血清皆有SMP30蛋白。在无荷瘤裸鼠血清未检测到SMP30蛋白。5、用2△△Ct。法比较SMP30mRNA的相对表达量,2周组瘤组织内SMP30mRNA表达量高于4周组和6周组,4周组高于6周组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。6、MSP结果显示,2周组各组裸鼠移植瘤组织SMP30基因启动子甲基化率为(37.74%)低于4周组(57.78%)和6周组(58.14%),差异均有统计学意义(均P0.05)。对临床切除的肝组织进行MSP检测,肝癌组织甲基化率(57.50%)明显高于正常肝组织(12.50%)和癌旁组织(17.50%),差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常肝组织和癌旁组织无差异。Spearman相关系数分析,SMP30蛋白的表达与血清AFP浓度无关。7、选取对SMP30mRNA干扰效率(65.58±12.69%)和对SMP30蛋白干扰效率(68.62±13.77%)都最高的RGN-homo-1681组为干扰序列。8、MTT法检测结果表明,空白组与对照组细胞之间无显著性差异(P>0.05),实验组经siRNA转染后细胞增殖程度显著增加,与前两组相比有显著性差异(P<0.05)。9、Transwell侵袭实验显示,siRNA干扰组较空白组和对照组穿膜细胞数量明显增加,差别有统计学意义(P<0.05),而空白组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。10、用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果发现虽然干扰组(7.54±1.36%)比其他两组(2.17±0.36%、3.36±0.28%)略有升高,但都属于正常范围。紫外灯照射后24h。流式检测结果发现,干扰组细胞、空白组和阴性对照组细胞凋亡率分别为45.45±±11.36%、25.54±4.33%和26.45±5.37%,干扰组与其他两组比,有明显差异(P<0.05),而空白组与阴性对照组无统计学差异(P<0.05)。11、Western-blot法检测紫外照射后Hep G2细胞内Bcl-2蛋白,实验组、空白组和对照组Bcl-2相对表达量分别为24.33±2.53、44.67±2.76和47.25±5.45,实验组的Bcl-2表达明显下降,有统计学差异(P<0.05),空白组与阴性对照组的Bcl-2表达无统计学差异(P>0.05)。12、Western-blot法检测紫外照射后Hep G2细胞内Bax蛋白,实验组、空白组和对照组Bax相对表达量分别为65.38±5.46、45.13±3.26和46.25±5.45,实验组的Bax表达明显升高,有统计学差异(P<0.05),空白组与阴性对照组的Bax表达无统计学差异(P>0.05)。13、用流式细胞仪检测细胞周期。实验组、空白组和对照组细胞增殖指数分别为44.38±5.28%、25.45±3.89%和26.25±5.64%,实验组的细胞增殖指数明显升高,有统计学差异(P<0.05),空白组与阴性对照组的细胞增殖指数无统计学差异(P>0.05)。结论：1、SMP30蛋白属于非经典途径分泌蛋白。2、细胞传代对Hep G2细胞内SMP30蛋白表达无明显影响。3、SMP30表达水平变化与肝癌发生发展有关。4、DNA甲基化是肝癌SMP30蛋白降低的原因之一。SMP30蛋白的表达与血清AFP浓度无关。5、SMP30可抑制Hep G2细胞的侵袭能力。6、SMP30可抑制紫外照射导致的Hep G2细胞凋亡,其机制之一为降低Bax/Bcl-2比值。

全文目录

主要名词的中英文对照缩表  5-7
摘要  7-11
ABSTRACT  11-17
前言  17-21
  参考文献  19-21
第一章 SMP30在肝癌发展过程中的表达情况  21-52
  1. 材料  21-26
  2. 方法  26-37
  3. 结果  37-43
  4. 讨论  43-48
  参考文献  48-52
第二章 SMP30在肝癌发展中的表达变化的机制探讨  52-78
  1. 材料  52-54
  2. 方法  54-61
  3. 结果  61-69
  4. 讨论  69-75
  参考文献  75-78
第三章靶向抑制SMP30基因表达对Hep G2细胞生物学特征的影响  78-109
  1. 材料  78-79
  2. 方法  79-84
  3. 结果  84-94
  4. 讨论  94-100
  参考文献  100-109
附录  109-114
综述衰老标记蛋白30的研究现状  114-138
  参考文献  126-138
致谢  138-139
攻读博士期间发表的论文  139

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