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RNA干扰靶向沉默PAUF基因对结肠癌细胞生物学行为影响的实验研究

作　者: 刘鹏飞
导　师: 朱新国
学　校: 苏州大学
专　业: 普外科
关键词: 结肠癌 siRNA PAUF β-catenin 增殖凋亡侵袭粘附迁移
分类号: R735.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：检测胰腺腺癌上调因子（pancreatic adenocarcinoma up-regulated factor，PAUF）和β-连环蛋白（β-catenin）在结肠癌患者中的表达情况，并通过RNA干扰靶向沉默PAUF表达，观察其对人结肠癌细胞HCT116增殖凋亡及侵袭能力的影响，探讨PAUF基因在结肠癌中的作用，为进一步研究结肠癌的基因治疗奠定基础。方法：1.收集48例结肠癌标本，每份标本同时收取肿瘤组织和癌旁正常组织。分别采用RT-PCR，免疫组化检测各组织中PAUF和β-catenin的表达水平。培养5株结直肠癌细胞株，RT-PCR检测各细胞株中PAUF表达水平，进而筛选出高表达细胞株HCT116以备后续实验用。2.以脂质体（lipofectamineTM2000）为载体将带荧光标记的siRNA转染HCT116细胞并用流式细胞仪检测从而筛选出最佳转染条件。设计制备针对PAUF基因的3组不同小干扰RNA序列，以最佳转染条件转染细胞后分别采用RT-PCR以及Western法验证干扰效果并进而筛选出最佳干扰片段以备后续实验用。3.将先前筛选出的最佳干扰片段PAUF-siRNA2按最佳转染条件对PAUF高表达细胞株HCT116进行RNA干扰，再分别采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法，流式细胞术（FCM），侵袭实验，粘附实验，迁移实验检测RNA沉默PAUF后对结肠癌HCT116细胞增殖，凋亡、周期及侵袭、粘附、迁移性的影响。结果：1.癌旁组织中PAUF和β-catenin的表达量明显低于肿瘤组织(P <0.05)。并且，在肿瘤组织和癌旁组织中PAUF的表达与β-catenin的表达均呈现相关性(P <0.05)。 PAUF在5株结直肠癌细胞中均有不同程度的表达，但在HCT116中表达量最高。2.细胞数约为每孔1.5×105个、siRNA浓度约为80pmol，Lipofectamine2000与siRNA比例为4ul:4ul(6孔板)时，有较佳的转染效率，继续提高siRNA浓度并不能明显提高转染效率。将三组siRNA转染细胞后PAUF表达量均有不同程度下降，其中以PAUF-siRNA2干扰效果最明显，转染细胞后PAUF和β-catenin的mRNA和蛋白表达明显下降。3.转染了PAUF-siRNA2的结肠癌细胞HCT116吸光度值降低，增殖活力下降，生长缓慢，细胞凋亡增加，且大部分停留在G2/M期，同时，细胞的侵袭、粘附及迁移性减低。结论：PAUF基因在结肠癌中高表达，沉默PAUF基因能使PAUF和β-catenin的表达明显下降，进而抑制结肠癌细胞株HCT116增殖并加速其凋亡，其周期大部分阻滞于G2/M期，同时其细胞的侵袭、粘附及迁移性减低。提示PAUF-siRNA能影响结肠癌细胞株中WNT/β-catenin通路的信号传导，通过靶向沉默PAUF基因，进而下调β-catenin分子的表达，抑制原癌基因激活，有可能成为靶向治疗结肠癌的新策略。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-9
引言  9-11
第一部分 PAUF 和β-catenin 在结肠癌中的表达及临床意义  11-26
  材料和方法  12-20
  结果  20-23
  讨论  23-25
  结论  25-26
第二部分 RNA 干扰靶向沉默 HCT116 细胞中 PAUF 表达的研究  26-38
  材料和方法  26-33
  结果  33-35
  讨论  35-37
  结论  37-38
第三部分 RNA 干扰靶向沉默 PAUF 表达对结肠癌细胞 HCT116 的生物学行为影响及机制研究  38-49
  材料和方法  38-41
  结果  41-45
  讨论  45-48
  结论  48-49
参考文献  49-53
全文总结  53-54
综述  54-59
  参考文献  56-59
全文缩略词  59-60
攻读学位期间公开发表的论文  60-61
致谢  61-62

RNA干扰靶向沉默PAUF基因对结肠癌细胞生物学行为影响的实验研究

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