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氧化应激中热休克蛋白90对20S蛋白酶体功能的影响

作　者: 王晓捷
导　师: 陈雪梅；邹飞
学　校: 南方医科大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 氧化应激 Hsp90α 20S Proteasome siRNA干扰
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景氧化应激是由于活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)产生和消除之间出现不平衡引起,会导致人体多种疾病和细胞损伤。ROS是指一类由氧形成的,化学性质较基态氧活泼的含氧代谢产物,包括氧自由基和非自由基的物质。一些外源性化学物质、药物、细胞因子或其他环境因素如紫外辐射、电离辐射等均可促使ROS的生成[1]。氧化应激在抗氧化剂缺失和超氧阴离子,过氧化氢,羟自由基这些ROS过度累积的时候发生。在许多疾病和环境损伤中,由于ROS产生和消除之间的不平衡引起的氧化应激可致衰老[2]、肿瘤发生、心血管疾病、神经退行性病变、风湿性关节炎和肺组织炎性病变[3]等多种疾病。氧化应激如活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)可直接作用于蛋白质,促进S-S键形成,碳链断裂、降解,及共价氧化修饰(如羰基化等),最终导致蛋白质的错误折叠和失活[4]。与氧化应激引起的其他生物学效应相比,蛋白质氧化先于脂质过氧化,且羟自由基与蛋白质直接相互作用的可能性要比DNA作用大20倍[5,6]。与构象异常的蛋白质能否重新正确折叠或及时被识别降解,即蛋白质质量控制(protein quality control, PQC),对维持氧化应激下细胞的正常功能和存活至关重要[7]。蛋白质质控系统由分子伴侣和蛋白水解酶组成[8]。首先,分子伴侣识别氧化应激下受损或错误折叠的蛋白质,并辅助其恢复正确构象；其次,分子伴侣将不可修复的受损蛋白转移至特殊的ATP依赖的蛋白酶,将其降解。如果外界的损伤因素引起泛素-蛋白酶体系统和分子伴侣功能显著降低,就会造成大量错误折叠的蛋白不能完全被降解而聚集,引起细胞损伤,从而引发多种疾病。蛋白质质控系统中,分子伴侣Hsp90α和属于泛素26S蛋白酶水解系统中的核心催化单位20S蛋白酶体发挥着重要作用。目前的研究大都集中于神经退行性疾病中二者之间的间接作用,然而氧化应激条件下Hsp90α对维持20S蛋白酶体的功能,协同发挥蛋白质质量控制功能也是至关重要的,但是两者之间是如何直接作用的,仍有待阐明。所以,对氧化应激条件下蛋白质质控机制的探索,将为探讨相关疾病的机理、疾病治疗、疾病预防和新药开发提供重要的理论基础。热休克蛋白(heat shock protein, Hsp)是机体在应激(病毒、感染、缺氧、紫外线照射等)状态下,合成的一组高度保守的蛋白质分子,故又称为应激蛋白。它广泛存在于原核和真核生物中,多以分子伴侣的形式参与相关蛋白的折叠、装配、细胞内运输及蛋白质降解等过程。Hsp的主要功能是维持细胞蛋白质正确构象,提高细胞对应激的耐受性,增强抗氧化作用,使细胞维持正常的生理功能。其中热休克蛋白90(heat shock protein, Hsp90)是细胞内最活跃的分子伴侣之一,同时也是与应激密切相关的保护性分子,它广泛参与细胞信号转导、激素应答及转录调控过程,对细胞在生理、病理及应激条件下的生存发挥了重要作用。在发生应激反应时,Hsp90可以和那些由于环境刺激而使自身构象发生改变的蛋白相互作用,保证蛋白进行适当的折叠并防止其非特异性聚集,从而维持细胞的正常活性[9]。Hsp90以同源二聚体αα,ββ形式存在于胞质,Hsp90α与Hsp90β在正常生理条件下都有表达,应激状态下如高温、感染可诱导其生成增加,但诱导因素有所不同。相比之下,Hsp90α易受热诱导,在肿瘤细胞增殖中起重要作用；而Hsp90β主要是细胞内的构成性表达,易受有丝分裂的诱导,与细胞分化和结构构建有关。所以在本次实验中,我们选用Hsp90α作为研究对象。蛋白酶体(Proteasomes)是一种普遍存在的巨型蛋白质复合物。在真核生物中,蛋白酶体位于细胞核和细胞质中。作为细胞内的“垃圾处理站”,它担负着真核细胞内70—90%的长生命周期蛋白与几乎全部短周期蛋白的降解[10],它是细胞用以调控特定蛋白质和除去错误折叠蛋白质的主要机制。其中20S蛋白酶体是催化核心颗粒。Proteasome降解的蛋白大多在细胞内担负着重要的功能,如细胞周期调控蛋白,细胞增殖与分化相关蛋白等。因此,Proteasome通过精确降解靶蛋白而参与基因转录和细胞周期调节、受体胞吞、抗原呈递等多种细胞生理过程[11]。与此同时它也是氧化应激损伤的靶目标。现有体外研究表明,蛋白酶体正常功能的实现,除依赖泛靶蛋白的泛素化和泛素化蛋白识别外,还与分子伴侣的作用密不可分[12]。但是单纯的体外蛋白质混合物的实验结果,是否能反应细胞内复杂的调控机制,仍有待研究。因此,我们通过探讨在氧化应激条件下两者在HepG2细胞内的作用关系来进一步阐明热休克蛋白90作为应激保护性分子的作用机制。目的：1.建立HepG2细胞氧化应激模型[13]；2.研究在氧化应激条件下,HepG2细胞内Hsp90α和20S Proteasome的表达情况,两者的共定位情况以及两者的相互作用情况；3.通过siRNA干扰方法建立稳定的Hsp90a抑制表达细胞株,从而抑制Hsp90α的表达;4.在上一步的基础上检测Proteasome活性的变化,观察Hsp90α表达下调后对Proteasome功能的影响,并以此进一步探讨热休克蛋白在氧化应激条件下对细胞保护作用的分子机制。方法：1.建立氧化应激HepG2细胞模型：将细胞分为对照组、氧化应激2h、4h、6h、8h、12h、24h组。氧化应激因素：500μmol/LH2O2,分别刺激相应的时间。通过ROS探针法观察细胞在不同氧化应激条件下ROS的分布和含量,通过MTT比色法观察氧化应激不同时间后细胞的存活情况。2.分别以免疫印迹,免疫荧光和免疫共沉淀方法检测氧化应激对细胞内Hsp90a及20S Proteasome的合成,二者的细胞内共定位以及细胞内相互作用情况的影响。3.将人Hsp90αRNA干扰基因片段连接入pSilencer 2.1-U6 neo载体,重组质粒pSilencerHsp90α经亚克隆、纯化、测序鉴定后,用电穿孔法转染到人肝癌细胞系HepG2细胞内。经G418筛选后,阳性克隆被进一步分离培养,形成稳定的Hsp90a抑制表达细胞株。用荧光定量PCR,免疫印迹检测siRNA干扰对Hsp90a的抑制效果4.将不施加处理因素的HepG2细胞作为空白对照组,应用Proteasome抑制剂MG-132作用HepG2细胞24h作为阳性对照组,将实验分为空白对照组,H202刺激6h组,H2O2刺激24h组,siRNA组,siRNA+6h组和阳性对照组。通过检测糜蛋白酶活性观察氧化应激和降低Hsp90a表达对Proteasome活性的影响。结果：1.ROS探针法结果：氧化应激后细胞内ROS的含量明显增多,并且ROS的分布从胞浆逐渐向胞核转移；2.MTT比色法测定细胞生存活力结果：在一定浓度的条件下,H202对细胞的增殖抑制呈时间依赖效应。随着作用时间的延长,对HepG2细胞增殖的抑制程度逐渐增强。(细胞活力：对照组>氧化应激4h组、6h组、8h组、12h组、24h组,P<0.05)；3.免疫印迹检测氧化应激对细胞内Hsp90a和20S Proteasome的表达量影响的结果：氧化应激导致胞内Hsp90a表达量增加,20S Proteasome表达量明显降低；4.免疫荧光检测Hsp90a和20S Proteasome细胞内共定位结果：氧化应激6h后,两种蛋白在胞浆中呈现一致的弥散分布,且20S Proteasome在胞浆内出现明显的点状聚集体；氧化应激24h后,20S Proteasome在胞浆内的聚集体呈现大量增加,并且有块状聚集体出现；5.免疫共沉淀检测Hsp90a和20S Proteasome细胞内相互作用的结果：分别以Anti-Hsp90α、Anti-20S Proteasome进行免疫共沉淀,结果均显示在氧化应激后Hsp90α和20S Proteasome在细胞内结合明显增多；6.Hsp90a抑制表达细胞模型的建立结果:invitrogen测序结果表明,Hsp90a干扰RNA片段DNA序列分析与预期完全相符；荧光定量PCR显示,与未干扰的对照组细胞相比,siRNA干扰组细胞的Hsp90αmRNA表达水平显著降低(P<0.05,t检验);免疫印迹结果显示,与对照组相比较,siRNA干扰组Hsp90a蛋白表达量减少有统计学意义(P<0.05,t检验)。7. Proteasome活性测定结果：与空白对照组相比,H202处理6h组的Proteasome活性无明显下降(P>0.05),H202处理24h的组别Proteasome活性有明显下降(P<0.05),siRNA干扰组Proteasome活性有着更为显著的下降(P<0.01),而siRNA+6h组Proteasome活性的下降却最为显著。H202处理6h的组别和siRNA+6h的组别相比,Proteasome活性变化有统计学差异(80.08±2.37%vs 21.08±3.27%,P<0.05)。结论：1.H202作用于HepG2细胞不同时间,对细胞产生不同程度的损伤。在24h内,作用的时间越长,细胞内产生的ROS越多,对细胞的增殖抑制越明显。2.氧化应激可影响细胞内Hsp90a和20S Proteasome的表达并改变其细胞内分布,并且两者的相互结合在氧化应激后增多,推测在这一过程中,Hsp90a对20SProteasome起着保护性的作用,从而减轻应激对20S Proteasome的直接损伤,维持其功能的稳定发挥。3.成功的建立稳定低表达Hsp90a的HepG2细胞株,为后续实验建立基础。4.氧化应激和降低Hsp90a的表达均可影响Proteasome的活性,而下调Hsp90a表达的同时施加H202处理对Proteasome的活性影响更为明显。进一步证明了Hsp90α对Proteasome有着保护性的作用。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
前言  16-27
  1. 氧化应激与蛋白质质量控制  16-18
  2. Hsp90  18-21
  3. 泛素-蛋白酶体系统  21-26
  4. 本研究的目的和意义  26-27
材料与方法  27-39
  1. 实验材料  27-31
  2 实验方法  31-38
  3. 统计学处理  38-39
结果  39-47
  1. 500μMH_2O_2处理不同时间后细胞内ROS的水平  39
  2. MTT检测细胞存活率  39-41
  3. 氧化应激对胞内可溶性Hsp90α和20S Proteasome的表达的影响  41
  4. Hsp90α和20S Proteasome有相似的细胞内分布(图4)  41-42
  5 胞内可溶性的Hsp90α和20S Proteasome相互作用存在变化(图5)  42-43
  6. Hsp90α抑制表达细胞模型的建立与鉴定  43-44
  7. 下调Hsp90α表达后,Proteasome活性的变化  44-47
讨论  47-50
结论  50-51
全文总结  51-52
参考文献  52-59
成果  59-60
致谢  60-62
统计学证明  62

氧化应激中热休克蛋白90对20S蛋白酶体功能的影响

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