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miRNA-214和miRNA-10a在结直肠腺癌中的表达、临床意义及其功能研究

作　者: 吴晨鹏
导　师: 张志勇; 赵增仁
学　校: 河北医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 结直肠肿瘤 miR-214 miR-10a 增殖 凋亡
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 21次
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内容摘要


目的：通过real time PCR技术检测miRNA-214和miRNA-10a在结直肠腺癌组织、相应切缘无瘤粘膜中的表达水平，分析二者的表达与结直肠腺癌患者临床病理特征的关系。同时检测miR-214和miR-10a在结肠癌细胞HCT116p53+/+和HCT116p53-/-中的表达水平，分析二者与p53基因的关系；应用平板克隆形成实验、MTT比色分析法以及流式细胞技术等方法检测miR-214对结肠癌细胞增殖、凋亡等过程的影响。探讨miR-214和miR-10a作为肿瘤标记物对结直肠腺癌的诊断价值，进一步阐明miR-214在结肠肿瘤发生发展过程中的作用机制，为深入了解结直肠腺癌发病及防治机制提供理论依据。方法：1收集2011年5月至2012年5月河北医科大学附属第四医院、河北医科大学附属第一医院结直肠腺癌患者新鲜组织标本共44例，包括结直肠腺癌肿瘤组织和相应切缘无瘤粘膜组织。2应用茎环逆转录荧光定量PCR方法检测结直肠腺癌组织和切缘无瘤粘膜组织中miR-214和miR-10a的表达水平，比较两组间表达差异，分析miR-214和miR-10a的表达与结直肠腺癌患者临床病理特征的关系。3选取9种结肠癌细胞(SW620、SW480、SW1116、HT29、DLD1、LOVO、Caco-2、HCT116p53+/+、HCT116p53-/-)进行细胞培养。4应用茎环逆转录荧光定量PCR方法检测结肠癌细胞中miR-214和miR-10a的表达水平，比较HCT116p53+/+细胞和HCT116p53-/-细胞中二者的表达差异，分析其与p53基因的关系。5对HCT116和SW1116两种细胞进行miR-214转染，实验组转染miR-214模拟物，对照组转染阴性对照物，同时设置空白组未做转染处理。6通过平板克隆形成实验观察细胞转染后HCT116细胞和SW1116细胞克隆形成情况，比较空白组、对照组和转染miR-214组间的差异。7HCT116细胞和SW1116细胞中进行细胞转染后12h、24h、36h、48h、60h，分别应用MTT比色分析法检测5个时段的OD值，绘制细胞生长曲线，分析空白组、对照组和转染miR-214组间细胞增殖改变情况。8应用流式细胞技术检测细胞转染后HCT116细胞凋亡情况，比较空白组、对照组和转染miR-214组间的差异。7应用spss13.0软件对数据进行统计分析，数据以中位数（四分位数间距）或均数±标准差表示，两组间配对样本采用Wilcoxon检验或配对t检验，两组间独立样本采用Mann-Whitney检验，重复测量数据采用双因素方差分析，均以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1miRNA-214和miRNA-10a在结直肠腺癌组织、相应切缘无瘤粘膜中的表达miR-214在44例结直肠腺癌组织和相应切缘无瘤粘膜中的表达水平分别为0.0264（0.0063，0.0591）和0.0505（0.0250，0.1121），结直肠腺癌组织中表达水平明显低于切缘无瘤粘膜组织，差异有统计学意义（Z=-2.591, P=0.0097）；miR-10a在44例结直肠腺癌组织和相应切缘无瘤粘膜中的表达水平分别为0.1108（0.0371，0.3482）和0.1841（0.0962，0.3243），结直肠腺癌组织中表达水平明显低于切缘无瘤粘膜组织，差异有统计学意义（Z=-2.486, P=0.0131）。2miR-214和miR-10a的表达与结直肠腺癌临床病理特征的关系miR-214和miR-10a的表达水平均与结直肠腺癌患者的组织学分型密切相关，即非粘液癌中的表达水平显著高于粘液癌（P=0.0138，P=0.0224），而与性别、年龄、部位、浸润深度、分化程度、淋巴结转移和临床分期无关（均P>0.05）。3miRNA-214和miRNA-10a在结肠癌细胞中的表达miR-214和miR-10a在结肠癌细胞SW620、SW480、SW1116、HT29、DLD1、LOVO和Caco-2中的表达均明显低于切缘无瘤粘膜组织。miR-214和miR-10a在HCT116p53+/+细胞和HCT116p53-/-细胞中的表达水平无明显差异。4miR-214对结肠癌细胞克隆形成的影响在SW1116细胞的平板克隆形成实验中，空白组和对照组间细胞克隆数无明显差异，转染miR-214组中细胞克隆数（369±19）明显低于对照组（667±28），差异有统计学意义（P=0.0006）；在HCT116细胞的平板克隆形成实验中，空白组和对照组间细胞克隆数无明显差异，转染miR-214组中细胞克隆数（130±17）明显低于对照组（413±78），差异有统计学意义（P=0.0269）。5miR-214对结肠癌细胞增殖活性的影响HCT116细胞和SW1116细胞转染miR-214后12h、24h、36h、48h、60h，通过MTT比色分析法检测OD值，空白组与对照组间均无明显差异，转染miR-214组在5个时段OD值均低于对照组，差异有统计学意义（均P<0.0001）。6miR-214对结肠癌细胞凋亡的影响HCT116细胞中，空白组和对照组间细胞凋亡率无明显差异；对照组早期细胞凋亡率（22.923±1.551%）明显低于转染miR-214组（28.263±2.195%），差异有统计学意义（P=0.0104），对照组晚期细胞凋亡率（4.093±0.792%）与转染miR-214组（3.903±0.395%）无明显差异。结论：1miR-214和miR-10a在结直肠腺癌中低表达，提示二者可能作为一种抑癌因子在结直肠腺癌发生过程中发挥抑癌作用。2miR-214和miR-10a在结直肠粘液癌中的表达水平显著低于非粘液癌，提示miR-214和miR-10a低表达与结直肠腺癌粘液的生成有关。3miR-214和miR-10a表达下调与p53基因尚未发现直接关系，其可能通过非p53通路发挥其抑癌作用。4miR-214可抑制结肠癌细胞的增殖，并可促进结肠癌细胞的凋亡。5深入研究miR-214和miR-10a抑癌机制可为阐明结直肠腺癌发病机制提供有力帮助，进一步作为新的潜在生物标记物，为结直肠腺癌患者的早期血清学筛查诊断提供新的思路。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤
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