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研究背景及意义结肠癌是世界常见恶性肿瘤之一,已经成为肿瘤相关死亡的第三位因素,每年有13万新增病例以及约5万患者死亡。传统的治疗方法对于大多数结肠癌患者的疗效不佳,抗肿瘤药物往往在应用一段时间后,结肠癌细胞即对其产生了耐药性。所以提高结肠癌的治疗效果是医疗界长期以来探索的目标,而尚未找到十分满意的治疗方法。因此,研究结肠癌的抗肿瘤药物的机制,寻求新的治疗靶点已成为迫切需要解决的问题。磷脂类物质是细胞膜的主要组成部分,在机体中主要包括甘油磷脂和鞘磷脂这两大类。鞘脂代谢产物已成为调节细胞基本生理过程的重要调节分子。这些磷脂的代谢产物在细胞内是重要的细胞信号分子。这些分子包括三大类：神经酰胺、神经鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸盐,三者在肿瘤的发生发展过程中发挥着极为重要的作用。其中,鞘氨醇-1-磷酸盐能促进细胞的存活和增殖,相反,神经酰胺和鞘氨醇,诱导细胞生长停滞和凋亡。这些在细胞内的具有相反功能的蛋白之间的相互转换暗示着通过调节它们之间的平衡能够决定细胞的命运——生存或死亡。研究证实,神经酰胺是一种细胞增殖的负性调节因子,能抑制细胞生长、促进细胞凋亡,而其被转化的代谢产物鞘氨醇-1-磷酸盐则抑制细胞凋亡、促进细胞增殖。细胞内神经酰胺、神经鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸盐可以发生相互转化,并通过酶促反应维持一个动态平衡。在这个动态平衡中有一个重要的调节酶——鞘氨醇激酶,是这种平衡的关键调节因子。鞘氨醇激酶是细胞内合成鞘氨醇-1-磷酸盐的主要限速酶,它通过降低神经酰胺向鞘氨醇-1-磷酸盐转化比率来调节两者,从而具备影响神经酰胺和1-磷酸鞘氨醇的双向功能。因此,神经酰胺和鞘氨醇-1-磷酸盐之间的动态平衡决定着细胞的凋亡和增殖。鞘氨醇激酶(SphK)家族共有2个亚型被证实、鉴定,分别是SphK1和SphK2。虽然哺乳动物中的SphKl和SphK2基因具有高度同源的保守区,但两者的组织分布和反应活性却明显不同。SphK1主要分布在脑、肺、心、脾和肝,而SphK2主要分布在肝和心。SphK1没有跨细胞膜结构域,而SphK2却有7个跨膜结构域。SphK1在各种哺乳动物细胞主要分布于细胞浆中,而SphK2在哺乳动物细胞中的分布比SphK1更复杂,在各种属细胞中的分布并不完全一致。SphK1和SphK2两者的表达有不同的时相性,表明两者有截然不同的生物功能及调控机制。SphK1被证实在小鼠的结肠癌模型中是高表达的,比结肠癌组织周边的正常组织的丰度高数十倍,SphK1能促进结肠肿瘤的生长,抵抗肿瘤细胞的凋亡,在其它的肿瘤组织中也得到了同样的证据。与SphK1这种单一的活性性质相反,SphK2在多种正常类型细胞中发挥促进凋亡、抑制细胞增殖的作用,而在多种肿瘤细胞中却促进增殖,抑制凋亡。所以,SphK2的功能是相当复杂的,至少在肿瘤细胞中的表现比SphK1的表现更复杂。在这两种亚型的研究中,因SphK1的功能较单一,所以得到了比较详尽的研究,而对于SphK2,因其表现出的复杂得多的活性行为,导致被人们所知的功能甚少,特别是在肿瘤细胞功能的研究中。丁酸钠(sodium butyrate, NaBT)是膳食纤维在肠道中被细菌酵解后产生的一种无毒的四碳短链脂肪酸,NaBT——丁酸的衍生物能够影响细胞的多种生理过程。最近研究证明,高浓度的NaBT可以诱导结肠癌、口腔癌、食管癌、肝癌、等多种肿瘤细胞凋亡,尤其在消化系统肿瘤细胞的凋亡疗法中成为被研究的热点。NaBT是一种组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制剂,属于非细胞毒性类抗肿瘤化合物,经常用作化疗药的一个辅助药物。已知NaBT会引起肿瘤细胞核内多种变化,包括引起细胞核内组蛋白的超乙酰化、DNA双链的甲基化及非组蛋白的一些被修饰。其中以组蛋白的超乙酰化最为重要常见,会导致mRNA水平的异常和抑制肿瘤细胞增殖。NaBT使组蛋白超乙酰化后,一些转录因子被激活,激活的转录因子结合到作用位点并激活某些基因,最终抑制细胞的增殖,又可诱导肿瘤细胞向正常细胞转化。对于NaBT的抑制去乙酰化的作用机制研究得很透彻,但是,NaBT对于诱导肿瘤细胞的凋亡作用是否与鞘氨醇激酶有关,以及如何诱导鞘氨醇激酶参与其中的机理并不清楚。蛋白激酶是一类胞内信使依赖酶,在蛋白质磷酸化与被磷酸化过程中起中介和放大作用并帮助完成细胞内的信号转导过程。蛋白激酶D(protein kinase D, PKD)作为一类特殊蛋白激酶家族,已经从蛋白激酶C家族中独立出来,其在细胞与细胞间的信号转导过程中发挥的重要作用逐渐为人们所认识。PKD家族主要包括PKD1、PKD2, PKD3三个成员。PKD在调节细胞增殖和诱导细胞凋亡过程中发挥重要的作用：被活化的PKD可以进入细胞核,PKD在细胞质和细胞核内的分布比例是由多个自身区域的调节来决定的。进入细胞核后,通过PKD中PH域酪氨酸磷酸化介导的PKD活化环磷酸化的相互作用激活PKD。活化的PKD通过激活核转录因子NF-KB,调节NF-KB依赖的基因表达。PKD诱导组蛋白去乙酰酶磷酸化,后者出细胞核来调节转录因子活性,。虽然结肠癌细胞的增殖受多条信号转导通路的调节,但是PKD信号通路是最重要的信号通路之一。PKD是介导细胞生存和增殖的重要分子,在肿瘤增殖过程中起着重要的作用。因些,我们在研究SphK2的功能时,首选PKD。本研究关注主要靶点：SphK2参与NaBT诱导的结肠癌细胞凋亡的机制,分析了SphK2在此模型中的功能改变以及它与凋亡之间的关系,初步探讨了SphK2在结肠癌对抗化疗药中发挥的作用,并深入探讨了凋亡的分子机制。为更好的理解SphK2和PKD在结肠癌细胞凋亡调控机制提供一个新的理论基础,并为抗癌药新药的设计提供新的依据。对开展以SphK2及PKD为靶点的结肠癌治疗提供理论依据。方法：1、建立NaBT诱导结肠癌细胞凋亡模型将人类结肠癌细胞株HCT116细胞用胎牛血清浓度10%完全培养基培养,置于37℃培养箱内培养(5%CO2)。细胞培养到对数生长期,传代接种,细胞分为空白对照组和NaBT处理组,在处理组中加入10mmol/L的NaBT,24小时后中止NaBT作用。用流式细胞仪检测各组细胞凋亡,Hoechst33342染色后荧光显微镜检测各组细胞凋亡形态变化。2、构建野生型SphK2质粒,观察过表达SphK2以及干扰SphK2后对细胞凋亡的影响及在凋亡中的作用。质粒构建后转染细胞,通过western blot方法检测过表达效率；干扰SphK2后,western blot方法检测干扰效率。流式细胞仪检测过表达以及干扰后分别与NaBT复合作用后的细胞凋亡变化。3、研究SphK2在NaBT诱导的结肠癌细胞凋亡模型中的作用方式及可能机制。NaBT处理细胞0h,lh,2h,3h后,western blot方法检测SphK2的活性形式即磷酸化SphK2的表达情况,以及胞浆中的SphK2的表达情况。NaBT处理细胞0h,4h,8h,12h,24h后,免疫荧光检测SphK2在细胞内的定位情况。探讨SphK2在NaBT诱导结肠癌细胞凋亡的可能作用机制。4、研究PKD在NaBT诱导的结肠癌细胞凋亡模型中的作用方式及可能机制。NaBT处理细胞0h,0.5h,1h,2h,4h后,western blot方法检测PKD的活性形式即磷酸化PKD的表达情况。PKD特异性的干扰片段转染细胞,western blot方法检测PKD干扰效率。SphK2和PKD特异性的干扰片段转染细胞,然后用NaBT处理细胞24小时,流式细胞仪检测干扰与NaBT复合作用后的细胞凋亡变化,以及免疫荧光检测SphK2在细胞内的定位情况。5、进一步探讨PKD和SphK2共同参与调节NaBT诱导的结肠癌细胞凋亡的具体分子机制SphK2和PKD特异性的干扰片段以转染细胞,然后用NaBT处理细胞24小时,western blot方法检测磷酸化的SphK2和磷酸化的PKD的表达情况。结果：1、NaBT诱导结肠癌细胞凋亡。成功建立凋亡模型,正常组凋亡值为3.373±0.361, NaBT处理组细胞凋亡值为21.130±1.243。相对于正常组, NaBT处理组凋亡显著增加(n=3,P<0.001)。2、SphK2抑制NaBT诱导的凋亡。为了探讨SphK2是否参与NaBT诱导的结肠癌细胞的凋亡.我们采用了细胞转染技术,分别下调或者过表达SphK2后加入NaBT然后观察这两种处理条件下,细胞凋亡的变化情况。细胞凋亡值在阴性对照组,SphK2干扰组,NaBT联合阴性对照组,NaBT联合SphK2干扰组四组中分别为2.470±0.153,3.443±0.052,21.800±0.537,32.337±3.809。相对于NaBT联合阴性对照组,细胞凋亡值在NaBT联合SphK2干扰组显著增加(n=3,P=0.016)；而细胞凋亡在对照组,SphK2过表达组,NaBT联合对照组,NaBT联合SphK2过表达组四组中分别为1.433±0.067,1.687±0.078,31.447±0.447,21.280±0.666。相对于NaBT联合对照组,细胞凋亡值在NaBT联合SphK2过表达组显著降低(n=3,P=0.017)。这些结果表明,SphK2确实抑制了NaBT诱导的结肠癌细胞的凋亡。3、SphK2通过胞浆的聚集抑制NaBT诱导的凋亡。因为蛋白激酶主要通过自身被磷酸化激活从而行使功能。为了进一步探讨SphK2以何种方式抑制NaBT诱导的凋亡,首先,我们用免疫印迹方法来检测细胞胞浆内的磷酸化SphK2蛋白水平变化。磷酸化SphK2蛋白表达在对照组,1h,2h,3h处理组中分别为100%±3.642%,150.098%±5.446%,282.038%±11.297%,468.343%±10.346%。相对于对照组,各时间点处理组磷酸化SphK2蛋白表达水平显著升高(n=3,P<0.001)。同时我们还检测胞浆中SphK2蛋白水平的变化。SphK2蛋白表达在对照组,2h,3h;4h,6h,8h,12h,24h处理组中分别为100%±4.742%,98%±4.876%,99%±3.642%,389.001%±16.899%,362.361%±11.236%,385.247%±10.341%,272.597%±9.332%,221.694%±9.649%。相对于对照组,4h,6h,8h,12h,24h时间点处理组胞浆中的SphK2蛋白表达水平显著升高(n=3,P<0.001)。我们还用激光聚焦显微镜观察了SphK2的定位情况。结果显示：在对照组中,SphK2主要分布在细胞核；而在NaBT处理4h,8h,12h,24h时间点诱导凋亡组,SphK2发生了重分布,SphK2从细胞核中转位到细胞浆,即发生了核输出,SphK2明显向细胞浆聚集。那么SphK2的这种胞浆聚集的现象与凋亡是不是有联系呢?以上数据联合第二点结果中提到的过表达对细胞凋亡的影响的流式结果可以说明SphK2是通过胞浆聚集的方式抑制了NaBT诱导的结肠癌细胞的凋亡。4、SphK2与PKD通过同一信号通路抑制NaBT诱导的凋亡。为了证实PKD也参与NaBT诱导的凋亡。我们首先检测了NaBT处理条件下,PKD活性的变化情况。PKD蛋白表达在对照组,0.5h,1h,2h,4h处理组中分别为100%±0.726%,202.495%±3.702%,271.248%±4.619%,397.579%±4.155%,265.978%±3.860%。相对于对照组,各时间点处理组PKD蛋白表达水平显著升高(n=3,P<0.001)。然后,我们检测了在干扰PKD以及SphK2条件下对于SphK2的定位的影响。在干扰PKD或干扰SphK2处理后,加入NaBT,相对于对照组,这两种处理都使得SphK2的胞浆的聚集消失了。最后,我们用流式细胞仪检测了两种处理后对细胞凋亡的影响。各处理组细胞凋亡值分别为：3.070±0.503,3.040±0.355,2.283±0.105,4.317±0.175,21.820±1.141,22.803±1.159,33.717±1.344,34.910±1.051。相对对照组,NaBT各处理组的凋亡值显著增加,但是NaBT复合PKD干扰组与NaBT复合SphK2、PKD干扰组相比,凋亡差异不显著(n=3,P=0.275)。这些结果提示,SphK2与PKD是通过同一个信号通路来调节NaBT诱导的细胞凋亡。5、PKD位于SphK2上游抑制NaBT诱导的凋亡。因为在第四点,我们已经证实了SphK2与PKD在同一信号通路上,那么到底谁是上游,谁是下游呢?为了弄清楚这个问题,我们用SphK2与PKD特异的干扰片段分别沉默SphK2与PKD,然后加入NaBT处理后,用免疫印迹的方法来检测磷酸化SphK2与磷酸化PKD的蛋白水平表达情况。磷酸化PKD蛋白表达在各组分别为100%±0.726%,101.385%±2.692%,481.384%±4.896%,487.217%±4.344%。相对于两个对照组,其余两个处理组磷酸化PKD蛋白表达水平显著升高(n=3,P<0.001)。磷酸化SphK2蛋白表达各组分别为100%±0.753%,102.375%±3.850%,101.253%±3.814%,578.259%±2.451%。相对于NaBT处理组,其余组SphK2蛋白表达水平显著降低(n=3,P<0.001)。干扰SphK2对于PKD的磷酸化无影响,而干扰PKD能完全的阻断SphK2的磷酸化。这些结果提示,PKD位于SphK2的上游。结论：SphK2通过PKD介导的核输出对NaBT诱导的结肠癌细胞的凋亡起着一个负性调节作用。在对抗肿瘤细胞的耐药性方面,PKD以及SphK2可能可以作用两个作用靶点,也就是说,通过下调PKD或者SphK2能够提高肿瘤细胞对化疗药的敏感性。但是,其中的详细机制有待进一步的探讨。
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