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大鼠脑缺血再灌注损伤Cathepsin B介导的细胞凋亡与ROCK-JNK信号通路的关系

作　者: 潘青
导　师: 张智博
学　校: 南华大学
专　业: 神经内科
关键词: 脑缺血再灌注 Cathepsin B 凋亡 ROCKⅡ p-MKK7 CA-074
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 24次
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内容摘要


目的缺血再灌注引起的神经元损伤包括坏死、凋亡、自嗜，其中凋亡是脑细胞死亡的重要方式，其主要发生在梗死中心区周围的缺血边缘区,也被称为缺血半暗带区，而减少这一区域神经细胞凋亡则成为关键。神经细胞参与凋亡的分子机制涉及范围较广，溶酶体组织蛋白酶B(Lysosome Cathepsin B)，ROCK-JNK信号通路等也参与其中，但其具体作用途径及机制尚不清楚。本研究试图通过Cathepsin B特异性抑制剂CA-074对大鼠进行干预，检测并分析ROCKⅡ、p-MKK7的表达的变化，探讨Cathepsin B与ROCK-JNK信号通路在缺血再灌注损伤诱导的神经细胞凋亡中的相互关系，为缺血性脑卒中的防治提供了新的思考方向。方法清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠67只，年龄约10-12周龄，体重约280±20g，随机分为假手术组（sham，n=7）、模型组1/2h（M-1/2h，n=6）、模型组6h（M-6h，n=6）、模型组12h（M-12h，n=6）、模型组24h（M-24h，n=12）、干预组1/2h（I-1/2h，n=6）、干预组6h（I-6h，n=6）、干预组12h（I-12h，n=6）、干预组24h（I-24h，n=12），其中假手术组取1只大鼠，模型组24h和干预组24h均取6只大鼠行TTC染色。使用Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞（MiddleCerebral Artery Occlusion，MCAO）模型，大鼠脑缺血2h后恢复再灌注，再灌注后取材时间点分为1/2h、6h、12h、24h；干预组采用侧脑室穿刺法注射CathepsinB特异性抑制剂CA-074（20ugCA-074溶于1ulDMSO中于MCAO前30分钟注射入右侧侧脑室[1]），假手术组和模型组于同一时间点及部位注射等量的DMSO溶液。采用Longa’s的5级标准评分法评价神经功能缺损症状；采用TTC染色法检测脑梗死体积、HE染色法病理形态学改变、TUNEL法及免疫组织化学法分别检测大脑缺血侧皮质区神经细胞凋亡变化及ROCKⅡ、p-MKK7的表达变化。结果1.造模成功率78.82%，模型组和干预组于缺血侧皮质及皮质下均可见白色梗死灶，模型组24h相对梗死体积为27.72±3.54%，干预组24h相对梗死体积为12.70±1.37%，但干预组相对梗死体积较模型组明显减少(P<0.001)，且神经功能缺损症状与体征也得到明显改善(P<0.05)。假手术组未见梗死灶，神经功能评分正常。2.缺血再灌注后24h各组脑梗死病理学改变HE染色显示：假手术组24h脑组织切片可见胶质细胞、神经细胞及毛细血管形态正常，结构完整、清晰，锥体细胞核大且圆，核仁明显；模型组24h呈缺血改变，梗死区正常组织结构消失，锥体细胞体积缩小，细胞核与细胞浆分界不清，细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红，部分细胞坏死，并可见呈筛状坏死的坏死灶，间质水肿，有炎细胞浸润；干预组24h脑组织缺血改变较模型组明显减轻，坏死灶范围缩小，细胞结构欠完整，细胞核固缩少，细胞间质水肿轻。3.在大鼠大脑缺血侧皮质区，模型组1/2h可见少量散在的凋亡神经细胞，6h、12h、24h逐渐增多（p<0.001）；CA-074干预组6h、12h、24h观察到凋亡细胞较模型组对应时间点有明显下降（p<0.05），而干预组1/2h凋亡细胞较模型组1/2h无明显变化（p>0.05）；假手术组在对应区域内凋亡细胞几乎很少见。4.在大鼠缺血侧皮质区，模型组再灌注1/2h即可见ROCKⅡ阳性细胞表达，6h、12h、24h持续上升（p<0.001）；除1/2h组无明显减少外（P>0.05），干预组余各个时间点ROCKⅡ蛋白表达较模型组明显下降（p<0.05）；假手术组在对应区域内未见明显ROCKⅡ阳性细胞表达。5.在大鼠大脑缺血侧皮质区，模型组再灌注1/2h可见大量p-MKK7阳性细胞表达，6h下降至低谷，后又逐渐上升，于再灌注24h再次达峰值，呈现两个峰值（p<0.05）；干预组24h p-MKK7阳性细胞表达较模型组明显减少（p<0.001），其它各个时间点p-MKK7阳性细胞表达较模型组明显下降（p<0.05）；假手术组在对应区域内未见任何p-MKK7蛋白表达。结论Cathepsin B可能通过其特异性抑制CA-074下调ROCK-JNK信号通路介导的凋亡信号转导，减少细胞凋亡和脑梗死体积。

全文目录


中文摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
第一章 前言  11-15
第二章 材料与方法  15-25
第三章 结果  25-35
第四章 讨论  35-44
第五章 结论  44-45
参考文献  45-52
附录  52-53
文献综述  53-61
参考文献(references)  58-61
攻读硕士学位期间发表得论文及参与得科研课题  61-62
致谢  62-63

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑血管疾病 > 急性脑血管疾病（中风）
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