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蓝萼甲素对缺氧缺血性脑损伤保护作用的研究

作　者: 汤晓蓉
导　师: 朱力
学　校: 苏州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 缺氧缺血蓝萼甲素凋亡
分类号: R722.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic ischemic brain damage，HIBD）是指围产期窒息导致大脑的缺氧缺血性损害，是造成新生儿死亡、神经功能失调的主要原因之一。在发展中国家，每1000名足月新生儿就有1-3名患有缺氧缺血性脑病（hypoxia-ischemia encephalopathy，HIE），该病死亡率较高，并可导致终生残疾。我国每年出生的新生儿有160～220万发生窒息，其中40万左右因重度脑损伤遗留瘫痪、癫痫、智力障碍等不同程度的残疾。新生儿时期脑发育是大脑发育关键期，一旦发生HIE，需积极、及时采取综合治疗的措施。为减少后遗症的发生，必须坚持恢复期治疗及早期干预康复治疗。目前治疗HIE的常用药物包括红细胞生成素、脑代谢激活剂、丹参、纳络酮及各类神经营养因子等。文献证实头孢曲松、环孢霉素A、NEP1-40、法舒地尔等心血管系统药物可以减轻缺氧缺血造成的脑损伤；还有研究报道阳雀花根等中药可显著提高小鼠抗缺血缺氧能力。本文也是致力于研究其他中草药对新生大鼠HIBD的保护作用，希望能为缺氧缺血性脑病患儿提供更加可靠、及时的药物治疗。现代药理研究表明，蓝萼香茶菜的乙醇提取液能减轻心肌缺血-再灌注损伤，保护心肌；蓝萼甲素可以通过抗血小板作用起到活血、心肌保护作用。并有研究证明蓝萼甲素具有抗凝血的作用。鉴于蓝萼甲素这些疗效，我们提出蓝萼甲素可能对新生儿缺氧缺血性脑病也具有保护作用的设想，因此，我们用新生大鼠建立缺氧缺血性脑损伤HIBD实验动物模型来模拟HIE，观察蓝萼甲素对新生儿HIBD的保护作用，并对其机制进行了研究。希望本研究能够为未来蓝萼甲素用于缺氧缺血性脑病患儿治疗提供实验依据。实验方法：1、蓝萼甲素的分离提纯。蓝萼甲素是从唇科香茶菜属植物香茶菜中提取分离出的二萜化合物。2、建立HIBD实验动物模型。实验动物选用出生7天的Sprague-Dawley大鼠，将选定大鼠随机分为三组：HI手术组（n=50）、蓝萼甲素处理组（n=55）、假手术组（n=50）。出生7天的Sprague-Dawley大鼠行右侧颈总动脉永久性结扎后持续缺氧2.5小时，建立HIBD实验动物模型。3、缺氧缺血（HI）手术4周后，大鼠断头取脑，观察比较手术组手术侧和对照侧、HI手术组与假手术组大脑的发育情况，判断缺氧缺血对大脑发育的影响。4、缺氧缺血（HI）手术4周后，进行Morris水迷宫定位航行和空间探索试验，研究缺氧缺血对新生大鼠远期学习记忆能力的影响。5、TTC染色检测蓝萼甲素对新生大鼠HIBD是否有保护作用。在缺氧缺血中间恢复时，蓝萼甲素处理组腹腔注射蓝萼甲素。HI手术48小时后，将大鼠断头取脑切成2mm厚度切片，TTC染色观察脑梗死情况。对比HI手术组和蓝萼甲素处理组脑梗死情况，判断蓝萼甲素对脑损伤是否具有保护的作用。6、研究蓝萼甲素对新生大鼠HIBD保护机制。HI手术后24小时，大鼠断头取脑提取脑组织蛋白，通过免疫印迹（western blotting）研究相关机制，检测细胞凋亡情况。实验结果：1、通过观察手术后脑发育情况以及神经行为学结果，证明HIBD实验动物模型建立成功。2、手术后4周，通过对比假手术组和HI手术组大脑发育情况，发现HI手术组手术侧脑半球出现明显萎缩情况（n=20，p<0.001），对侧脑半球正常；假手术组大鼠大脑左右两侧均正常，说明缺氧缺血会严重影响大脑发育。3、Morris水迷宫定位航行试验结果显示，HI手术组大鼠寻找平台潜伏期时间明显长于假手术组（n=10， P <0.01）。空间探索试验结果显示，HI手术组大鼠穿越平台次数较假手术组少（n=10，P <0.01）。证明HIBD对大脑发育的影响是长期性的，可导致大鼠远期空间学习记忆功能障碍。4、TTC染色检测大脑梗死情况，对比HI手术组，发现蓝萼甲素处理组可降低新生大鼠脑缺氧缺血后48小时的脑梗死面积（n=10，p<0.01）。5、新生大鼠脑缺氧缺血后cleaved caspase-3的表达量明显升高（n=10，p<0.001），表明脑损伤后凋亡增加，蓝萼甲素处理组可明显降低cleaved caspase-3（n=10，p<0.01）的表达，表明蓝萼甲素通过抑制凋亡起到神经保护作用。蓝萼甲素还通过降低AKT的磷酸化水平（n=10，p<0.01）、升高ERK磷酸化水平（n=10，p<0.01）起到保护作用。结论：缺氧缺血会影响新生大鼠大脑发育，导致大鼠远期空间学习记忆功能障碍。蓝萼甲素对缺氧缺血性脑损伤有保护作用，可能通过减少细胞凋亡完成。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-11
前言  11-19
材料和方法  19-26
  一、实验动物  19
  二、实验试剂  19
  三、仪器设备  19-20
  四、实验方法  20-26
    （一）、蓝萼甲素的分离、提纯  20
    （二）、缺氧缺血性脑损伤（HIBD）实验动物模型及实验动物分组  20-21
    （三）、脑萎缩研究  21
    （四）、神经行为学检测  21-22
    （五）、梗死面积检测  22
    （六）、免疫印迹  22-26
实验结果  26-33
  一、蓝萼甲素的分子结构和高效液相色谱分析图  26
  二、致死率  26
  三、新生大鼠缺氧缺血性脑损伤严重影响大脑发育  26-27
  四、新生大鼠缺氧缺血性脑损伤严重损伤大鼠远期空间学习记忆功能  27-29
  五、蓝萼甲素可减少新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后脑梗死面积  29-30
  六、蓝萼甲素可减少 Cleaved Caspase-3 的表达  30-31
  七、蓝萼甲素可升高 AKT 的磷酸化  31-32
  八、蓝萼甲素可降低 ERK 的磷酸化  32-33
分析与讨论  33-36
实验结论  36-37
参考文献  37-41
综述  41-52
  综述参考文献  46-52
硕士学位期间发表的论文  52-53
致谢  53-54

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