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IL-22结构功能及其在酒精性肝病和暴发性肝炎中的作用研究

作　者: 邢微微
导　师: 于晓妉; 徐东刚
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: 白细胞介素-22 酒精性肝病肿瘤坏死因子-α 暴发性肝炎氧化应激凋亡
分类号: R575
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

白介素-22 (Interleukin-22, IL-22)是IL-10细胞因子家族成员之一,两者具有22%的同源性。不同于传统意义上的“白介素”,IL-22是一种新型的免疫介质,它由激活的Th细胞(Th1,Th17,Th22细胞)以及天然免疫细胞(NK细胞,ILC细胞)分泌产生,但却并不作用于这些细胞。IL-22主要作用于少数组织器官(皮肤,肝脏,胰腺,小肠,肺脏等)的实质细胞,发挥促炎,天然免疫调节,组织保护及修复等功能。在表皮炎症如银屑病中,IL-22作为一种重要的炎性介质,在其病理生理中扮演关键角色。而在Crohn’s病,溃疡性结肠炎以及自身免疫性心肌炎等疾病中IL-22则发挥保护作用。目前认为IL-22促炎或组织修复保护的双重功能可能与具体的组织类型及局部的细胞因子环境密切相关。在肝脏,IL-22似乎是肝细胞的存活因子,多种毒性物质诱导的肝损伤模型以及肝部分切除模型均证实IL-22可以促进肝细胞的存活与再生。然而目前对于IL-22的肝保护作用机制了解甚少。我们对IL-22的结构和功能及其在常见肝病中的作用和机制进行了深入研究。在IL-22的结构和功能研究方面,在已知IL-22晶体结构基础上,利用Homology程序(Insight II 2000软件包, Octane2图形工作站)从理论上模拟IL-22的胞外区三维结构,通过表观静电分析,可及性表面积分析并结合细胞因子结构特征对IL-22可能的受体结合区进行分析,将潜在的受体结合区定位于LoopAB N末端的67~72位氨基酸。我们通过点突变构建了一系列IL-22突变体,通过分析其促细胞增殖活性及其对STAT3转录活性的影响,发现该区域氨基酸位点变化可影响其生物学功能。综合计算机模建与生物学功能分析的结果,我们确定该区域为IL-22潜在的受体结合位点。多种毒性物质诱导的实验性肝损伤模型均证实IL-22的肝细胞保护作用,然而不同肝脏疾病具有不同的病理生理特点,IL-22在其它肝病中作用如何?其可能的机制是什么?对这些问题的深入研究有助于拓展对IL-22功能及作用机制的认识,为筛选新的肝病治疗药物提供思路。酒精滥用是一个世界性的问题,全球每年约有3.2%死亡病例与酒精相关,酒精性肝病是酒精滥用最主要的临床表现,在我国其发病率仅次于病毒性肝炎,造成极大的医疗负担。尽管针对酒精性肝病的研究已进行数十年,但至今尚无有效的治疗药物。为评价IL-22在酒精性肝病中的作用,我们分别建立了大鼠慢性酒精性肝炎模型及小鼠急性酒精性肝损伤模型。在前期研究的基础上,我们采用酒精,高脂及碳酰铁联合诱导建立大鼠酒精性肝炎模型,结果表明随着造模时间的延长,大鼠血清转氨酶水平进行性升高,组织病理损伤不断加重,32周时出现肝细胞气球样变,大量中性粒细胞浸润以及Mallory小体形成等典型的酒精性肝炎病理学指征,提示模型建立成功。在此基础上我们利用IL-22对其进行治疗评价,结果表明IL-22可以降低血清转氨酶,总胆固醇及甘油三酯的升高,明显改善肝组织病理学变化。在整个治疗期间,IL-22处理并未引起大鼠一般状态及体重发生明显变化。在利用慢性酒精性肝炎模型对IL-22作用进行评价后,我们又建立小鼠急性酒精性肝损伤模型,进一步分析IL-22在酒精诱导的肝损伤中的作用。结果显示,急性酒精灌注可以诱导血清转氨酶(ALT,AST,GGT)升高,囊泡状肝脂变的出现,肝细胞凋亡增加,肝组织氧化应激及TNF-α表达升高,而IL-22治疗可明显抑制上述不利变化。暴发性肝炎是由于病毒性肝炎,酒精或其他肝毒性物质诱发的一种临床危重症,由于缺乏有效的预防及治疗手段,预后极差。GalN/LPS诱导的小鼠急性致死性肝损伤模型是临床暴发性肝炎的经典动物模型,我们利用这一模型对IL-22在其中的作用及可能的机制做进一步研究。结果表明,IL-22可明显降低GalN/LPS诱导的暴发性肝炎的死亡率,明显改善肝组织病理损伤,降低血清转氨酶的升高,减轻肝组织的氧化应激,抑制肝细胞的凋亡,降低血清炎性因子TNF-α的升高。机制研究表明IL-22可以激活肝组织STAT3的磷酸化,诱导抗凋亡蛋白Bcl-xL,抗氧化因子HO-1及Ref-1的表达上调。上述结果提示IL-22可能通过抑制炎性因子的升高,诱导抗凋亡及抗氧化蛋白的表达来发挥肝保护作用。为深入研究IL-22作用机制,我们又利用GalN/LPS诱导的暴发性肝炎的体外模型,即TNF/ActD诱导的HL7702细胞凋亡模型对IL-22的肝保护作用机制进一步分析,结果表明IL-22可以抑制TNF/ActD诱导的HL7702细胞的凋亡,其可能机制是IL-22通过STAT3信号路径,诱导抗凋亡蛋白Bcl-xL及HO-1的表达而发挥其保护作用。综上所述,我们利用计算机同源模建分析预测了IL-22潜在的受体结合区,对上述区域进行突变,构建了系列IL-22突变体。通过检测IL-22系列突变体的促增殖活性及STAT3转录活性确定了这一区域为IL-22受体结合区。利用慢性酒精性肝炎模型,急性酒精性肝损伤模型以及暴发性肝炎模型对IL-22在上述肝病中的作用进行了研究,结果表明IL-22可以明显减轻上述肝病模型的病理损伤,有效改善肝功,其保护机制可能与抑制炎性因子的表达,抗凋亡及抗氧化作用相关。鉴于IL-22明确的肝保护作用及其靶点的局限性,IL-22具有成为肝病治疗药物的潜力。

全文目录

缩略词表  6-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-14
第一部分人IL-22 的结构与功能研究  14-32
  前言  14-15
  第一章人IL-22 受体结合区的预测  15-18
    1. 材料与方法  15
    2. 结果  15-18
  第二章人IL-22 系列突变体的构建，表达及纯化  18-26
    1. 材料与方法  18-21
    2. 结果  21-26
  第三章人IL-22 系列突变体功能分析  26-30
    第一节 IL-22 系列突变体促L02 细胞增殖活性分析  27-28
      1. 材料与方法  27
      2. 结果  27-28
    第二节 IL-22 系列突变体诱导STAT3 转录活性分析  28-30
      1. 材料与方法  28-29
      2. 结果  29-30
  讨论  30-32
第二部分 IL-22 对酒精性肝病的作用及其机制研究  32-52
  前言  32-33
  第一章慢性酒精性肝炎模型的建立及IL-22 的治疗评价  33-38
    1. 材料及方法  33-34
    2. 结果  34-36
    3. 讨论  36-38
  第二章 IL-22 对急性酒精灌注诱导的肝损伤的治疗评价及机制研究  38-52
    1. 材料和方法  38-45
    2. 结果  45-50
    3. 讨论  50-52
第三部分 IL-22 对GalN/LPS 诱导的暴发性肝炎的作用及机制探讨  52-72
  前言  52-53
  第一章 IL-22 对GalN/LPS 诱导的暴发性肝炎模型的治疗评价及机制研究  53-65
    1. 材料和方法  53-57
    2. 结果  57-63
    3. 讨论  63-65
  第二章 IL-22 对 TNF/ActD 诱导的 HL7702 细胞凋亡的抑制作用及其机制研究  65-72
    1. 材料和方法  65-66
    2. 结果  66-70
    3. 讨论  70-72
第四部分 IL-22 初步药代学研究  72-75
  前言  72
  1. 材料与方法  72-73
  2. 结果  73
  3. 讨论  73-75
参考文献  75-80
全文总结  80
创新点  80-81
附录  81-87
个人简历以及在读期间发表的论文、所获奖励  87-88
发表综述  88-95
  参考文献  92-95
致谢  95

IL-22结构功能及其在酒精性肝病和暴发性肝炎中的作用研究

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