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结核分枝杆菌Rv1738、TB31.7及RPFE的表达纯化及免疫特性分析

作　者: 霍如松
导　师: 焦新安
学　校: 扬州大学
专　业: 遗传学
关键词: 结核分枝杆菌抗原蛋白原核表达免疫特性
分类号: R378.911
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)所引起的以呼吸系统感染为主的慢性传染病,它是现今世界范围内最主要的疾病之一。据WHO估计,当前全世界约有1/3人口感染了结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB),我国的结核病患者数量居世界第二位,感染人数已达到4亿。而这部分人中只有10%可能最终发展为活动性结核,而绝大多数为潜伏感染。卡介苗(Bacille Calmette and Guerin, BCG)是牛结核分枝杆菌的减毒株,是目前唯一用于TB预防的疫苗,但其对潜伏感染者无效,并且存在着保护期短、免疫应答较弱等缺陷。因此,为了减轻结核病造成的负担,新型抗原的筛选和新型疫苗的研制迫在眉睫。有国外学者利用生物信息学的方法,预测出抗原候选分子,本研究从这些候选分子中选取了3个评分最高的蛋白,对其进行原核表达和纯化,并对其免疫应答特性进行分析。1.结核分枝杆菌Rv1738、TB31.7及RPFE蛋白的表达纯化和鉴定以MTB蛋白Rv1738、TB31.7和RPFE为研究对象,首先从H37Rv基因组DNA上PCR扩增其相应的编码基因,克隆筛选和序列鉴定正确以后,利用pET30a或pET32a构建原核表达质粒。将鉴定正确的重组表达质粒转化BL21(DE3),诱导表达。对融合蛋白进行亲和层析纯化,并通过Western blotting实验对蛋白的免疫反应性进行分析。诱导表达后,SDS-PAGE结果显示,各目的蛋白都得到成功表达,其中Rv1738和RPFE主要以可溶形式存在,而TB31.7主要以包涵体形式表达。对于包涵体蛋白我们采用了缓慢变复性的方法使其变为可溶性形式存在。各融合蛋白与兔抗H37Rv多抗血清的Western blotting结果都显示出了特异性目的条带,显示出良好的免疫反应性。2.结核分枝杆菌Rv1738、TB31.7及RPFE蛋白免疫特性分析将Rv1738、TB31.7和RPFE三种融合蛋白与DDA佐剂等体积充分乳化后皮下接种免疫6周龄雌性C57BL/6小鼠,三免两周后摘眼球处死小鼠,采血清和制备淋巴细胞分别进行抗体效价和细胞因子测定。抗体检测结果显示,在三种融合蛋白免疫小鼠的血清中均可以检测到高水平的特异性抗体。夹心ELISA分析三种蛋白作为刺激剂活化淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的差异,结果显示,三种蛋白刺激细胞产生较高水平的IFN-γ和IL-2,其中IFN-γ的分泌水平明显高于IL-2。三种蛋白刺激细胞产生IL-4的水平很低。结果表明,三种蛋白具有优良的免疫原性,它们所诱导的免疫应答趋向于Thl型,这为进一步的研究提供了重要的信息

全文目录

摘要  2-4
Abstract  4-6
目录  6-7
符号说明  7-9
第一章综述  9-24
  1 结核病流行病学概况  9-10
  2 机体抗MTB的免疫应答  10-16
  3 TB疫苗的研究进展  16-18
  4 结语  18
  参考文献  18-24
第二章结核分枝杆菌Rv1738、TB31.7及RPFE蛋白的原核表达、纯化和鉴定  24-37
  1 材料与方法  24-28
  2 结果  28-33
  3 讨论  33-34
  参考文献  34-37
第三章结核分枝杆菌Rv1738、TB31.7及RPFE蛋白免疫特性分析  37-47
  1 材料与方法  37-40
  2 结果  40-44
  3 讨论  44-45
  参考文献  45-47
致谢  47-48

结核分枝杆菌Rv1738、TB31.7及RPFE的表达纯化及免疫特性分析

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