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纹皮蝇Hypodermins A，C基因DNA疫苗的构建及其小鼠免疫特性的初步研究

作　者: 娜仁高娃
导　师: 呼和巴特尔
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛皮蝇蛆病 Hypodermin A Hypodermin C DNA疫苗 免疫特性
分类号: S855.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


牛皮蝇蛆病是一种危害严重的人畜共患病,每年都给养牛业带来巨大的经济损失。国内外研究表明纹皮蝇Hypoderomin A(HA),Hypodermin B(HB)和Hypodermin C(HC)是该病血清学诊断和免疫疫苗的候选抗原。为了避免药物残留和亚单位疫苗的各种缺陷,本实验以纹皮蝇Ⅰ期幼虫两种免疫相关基因构建了DNA疫苗,并在免疫水平上进行了研究,为牛皮蝇的免疫防治研究奠定了基础。本研究根据Genbank上的Hypodermins A,C基因序列设计上下游引物,以本实验室构建的pETHA、pETHC为模板PCR扩增HA和HC基因,以上PCR产物连接到pMD19-T克隆载体上并进行序列测定。将序列测定正确的目的片段(HA和HC)再亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒(pcHA、pcHC)并经过测序确定其正确性。结果表明,HA和HC基因序列同GenBank上公布的序列(登录号:L24914、AB054066)核苷酸同源性均为100%,成功构建了DNA疫苗pcHA和pcHC。牛皮蝇幼虫抗原基因原核表达菌BL21(含pETHA)、原核表达菌BL21(含pETHC)以最佳诱导时间均为4h,最佳IPTG浓度均为0.05mmol/L,最佳诱导温度分别为37℃、30℃进行诱导表达、提取重组蛋白包涵体、经8mol/L尿素变性透析复性后,再以Sephadex G-75纯化后得到纯化的重组蛋白rHA和rHC,然后免疫新西兰白兔制备高免抗血清。将构建好的DNA疫苗pcHA、pcHC和空载体pcDNA3.1(+)体外转染小鼠胎儿成纤维细胞,然后以兔抗rHA、rHC的高免血清作为一抗,FITC标记的山羊抗兔IgG为二抗做间接免疫荧光试验IFAT检测细胞内目的基因编码蛋白的表达情况。结果表明转染重组质粒的小鼠胎儿成纤维细胞在倒置显微镜下均可见到均质的蓝绿色荧光,而转染pcDNA3.l(+)的小鼠胎儿成纤维细胞中无荧光出现,表明表达的蛋白能与兔抗rHA或rHC的多抗发生特异性结合。用DNA疫苗pcHA、pcHC和pcHA+pcHC经双侧胫前肌注射免疫BALB/c小鼠,对小鼠进行了体液免疫水平研究。实验组(pcHA、pcHC、pcHA+pcHC)中小鼠血清IgG滴度随免疫次数的增加而提高,呈现一种逐渐上升的趋势,而对照组(PBS、pcDNA3.1(+))中小鼠血清IgG滴度基本上不随免疫次数的变化而提高。实验组和对照组之间差异极显著(P﹤0.01),而对照组组内差异不显著(P﹥0.05)。结果表明DNA疫苗pcHA、pcHC和pcHA+pcHC均能诱导体液免疫。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-9
1 引言  9-19
  1.1 牛皮蝇的生物学特性  9-10
    1.1.1 牛皮蝇的病原形态  9
    1.1.2 牛皮蝇的生活史  9-10
  1.2 国内外牛皮蝇蛆病防治研究进展  10-12
    1.2.1 药物防治  10-11
    1.2.2 疫苗的研究进展  11-12
  1.3 疫苗的发展概况  12-14
    1.3.1 常规疫苗的发展概况  12-13
    1.3.2 DNA 疫苗的发展概况  13-14
  1.4 寄生虫DNA 疫苗研究进展  14-17
    1.4.1 疟原虫 DNA 疫苗  15
    1.4.2 日本血吸虫 DNA 疫苗  15-16
    1.4.3 隐孢子虫病 DNA 疫苗  16-17
    1.4.4 弓形虫病 DNA 疫苗  17
  1.5 本研究的目的和意义  17-19
2 试验研究一纹皮蝇单价DNA 疫苗的构建  19-35
  2.1 实验材料  19-20
    2.1.1 菌株与质粒载体  19
    2.1.2 主要的酶和试剂  19-20
    2.1.3 仪器与设备  20
  2.2 实验方法  20-27
    2.2.1 引物设计  20
    2.2.2 HA、HC 基因 PCR 扩增  20-21
    2.2.3 HA、HC 基因的 A-T 克隆  21-25
    2.2.4 重组表达载体的构建  25-27
  2.3 实验结果  27-33
    2.3.1 HA、HC 基因 PCR 扩增  27-28
    2.3.2 重组克隆菌的筛选  28-30
    2.3.3 DNA 疫苗重组表达菌的筛选  30-33
  2.4 讨论  33-35
3 试验研究二 DNA 疫苗 pcHA、pcHC 在小鼠体内免疫特性的研究  35-46
  3.1 实验材料  35
    3.1.1 实验动物及表达菌株  35
    3.1.2 主要的酶和试剂  35
    3.1.3 仪器与设备  35
  3.2 实验方法  35-40
    3.2.1 原核表达菌的诱导表达及重组蛋白的变性、复性和纯化  35
    3.2.2 rHA、rHC 抗血清的制备  35-36
    3.2.3 DNA 疫苗在小鼠胎儿成纤维细胞中的瞬时表达  36-38
    3.2.4 ELISA 方法检测免疫 DNA 疫苗pcHA、pcHC 后小鼠体内诱导抗体的水平  38-40
  3.3 实验结果  40-44
    3.3.1 原核表达菌的诱导表达及纯化  40-41
    3.3.2 高免血清的抗体效价检测  41
    3.3.3 DNA 疫苗在小鼠胎儿成纤维细胞中的瞬时表达  41-42
    3.3.4 小鼠血清特异性抗体的检测  42-44
  3.4 讨论  44-46
4 结论  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-54
附录  54-57
作者简介  57

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医寄生虫病学
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