学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

中国对虾蛋白Rab7与WSSV囊膜蛋白VP28的共定位及其作用区域解析

作　者: 卢金凤
导　师: 黄倢
学　校: 上海海洋大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 中国对虾 WSSV PcRab7 RACE VP28 原核表达 基因缺失 细胞定位
分类号: S945
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 40次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


对虾白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是引起养殖对虾大规模死亡的主要病毒性病原之一，目前在分子或基因水平上研究其流行病学、理化特性、基因、蛋白特性等已取得了一些突破性的进展。随着全基因组序列的公布，研究学者对WSSV功能基因的研究主要集中在病毒囊膜蛋白的研究，目前已经确定的囊膜蛋白有VP28，VP26， VPl9，VP466和VP37等20多种。囊膜蛋白可以同宿主细胞膜上的特异受体结合并介导病毒包膜和宿主细胞膜的融合，从而启动病毒进入宿主细胞，现已发现PmRab7、β-integrin、Hsc70、BP53、PmCBP和STAT等宿主蛋白可以和WSSV囊膜蛋白结合。PmRab7是斑节对虾体内的一种小GTP结合蛋白，有研究表明该蛋白与WSSV囊膜蛋白VP28特异性结合，并且其重组蛋白或抗体都可以降低WSSV感染对斑节对虾的死亡率；另有RNA干扰结果表明，注射dsRNA-PmRab7沉默pmrab7基因的表达能够抑制WSSV和黄头病毒(yellow head virus，YHV)对斑节对虾的感染，推测PmRab7可能参与了病毒复制过程中的内吞运输。综上所述，Rab7在对虾防御WSSV中所起的作用不容忽视，但该蛋白是否分布在细胞膜上以受体身份参与WSSV感染，还是分布在细胞内以结合因子身份参与感染目前尚未知。本论文通过研究中国对虾体内的Rab7与VP28的定位关系，解析二者相互作用的功能区域，为进一步阐明Rab7在WSSV发生与发展过程中的作用机制提供了理论依据。本研究主要包括4部分：利用cDNA末端扩增（RACE）技术克隆中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）Rab7基因（pcrab7）全长cDNA；通过构建重组原核表达载体pBAD/gIIIA-pcrab7，诱导表达和纯化PcRab7蛋白，并制备PcRab7多克隆抗体；利用免疫印迹结合法（Western Blot）、Dynabeads磁珠免疫结合法和荧光免疫分析（FIA）检测VP28和PcRab7的作用及二者的具体结合位点；利用免疫荧光细胞化学染色通过激光共聚焦显微镜分析Rab7在中国对虾血淋巴细胞中的定位以及与VP28的关系。1、中国对虾Rab7基因（pcrab7）全长cDNA克隆：利用RACE方法成功克隆了中国对虾pcrab7全长cDNA (GenBank：JF742050），并对该基因进行了生物信息学分析。pcrab7全长1369bp，含有1个615bp开放阅读框，编码205个氨基酸，编码产物的估算分子量23.2KD。通过对pcrab7编码蛋白的序列分析显示，该基因产物具有许多Rab蛋白家族成员的共同特征，其氨基酸序列与凡纳滨对虾和斑节对虾的PcRab7蛋白的同源性为100%，其基因序列与凡纳滨对虾和斑节对虾的pcrab7基因的同源性分别为96%和97%。2、PcRab7蛋白表达及多克隆抗体制备：构建重组表达载体pBAD/gIIIA-pcrab7，转化到大肠杆菌E. coli内，用L-阿拉伯糖在37℃诱导重组基因工程菌，经SDS-PAGE和对表达序列标签（6×His）的检测，鉴定得到重组的目的蛋白，并利用纯化的重组蛋白制备了兔抗PcRab7多克隆抗体。3、VP28与PcRab7的结合及作用区域的分析：通过Western Blot和Dynabeads磁珠免疫结合法验证了PcRab7能与VP28结合；并且通过构建PcRab7的基因缺失片段，利用Western Blot和FIA进一步分析了VP28和PcRab7的具体结合位点，初步发现PcRab7的第41-79AA和第125-160AA这两个片段与VP28有结合活性。4、PcRab7与VP28在中国对虾血淋巴细胞中的定位分析：利用免疫荧光细胞化学染色法通过激光共聚焦显微镜对PcRab7在中国对虾血淋巴细胞中进行了定位，结果表明PcRab7主要分布在细胞膜内，膜外几乎没有PcRab7的分布；通过PcRab7与VP28的共定位分析，发现PcRab7与VP28以均匀结合的方式分布在细胞膜内，仅少数点状分布在细胞膜外；提前加入VP28可促使PcRab7在细胞膜外的分布。本论文为进一步研究PcRab7与VP28在WSSV感染过程中的作用机制奠定了基础。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-15
引言  15-17
第一章 绪论  17-22
  1 对虾白斑综合征病毒（WSSV）研究概况  17-18
  2 WSSV 囊膜蛋白在 WSSV 感染中的研究进展  18-19
    2.1 囊膜蛋白在 WSSV 侵染中的作用  18
    2.2 囊膜蛋白及其受体的相互作用  18-19
  3 Rab7 蛋白的研究现状  19-20
  4 展望  20-22
第二章 中国对虾 Rab7 基因全长 cDNA 的克隆与序列分析  22-37
  1 材料与方法  22-29
    1.1 中国对虾  22
    1.2 实验用仪器和主要试剂  22
    1.3 中国对虾鳃组织总 RNA 的提取和 cDNA 第一链的合成  22-24
    1.4 同源克隆 pcrab7 基因的部分片段  24
    1.5 RACE 获得全长 cDNA 序列  24-28
    1.6 pcrab7 全长 cDNA 序列分析及其编码的氨基酸序列的生物信息学分析  28-29
  2 结果  29-36
    2.1 同源克隆获得 pcrab7 基因的部分片段  29
    2.2 pcrab7 的 5'-RACE 和 3'-RACE  29-31
    2.3 pcrab7 基因序列特征  31-32
    2.4 PcRab7 蛋白结构特征分析  32-33
    2.5 中国对虾 Rab7 基因及其同源基因的分子系统学分析  33-34
    2.6 不同种类 Rab7 蛋白保守性分析  34-36
  3 讨论  36-37
第三章 中国对虾 Rab7 蛋白的原核表达与多克隆抗体制备  37-50
  1 材料与方法  38-45
    1.1 质粒和菌种  38
    1.2 实验用仪器和主要试剂  38
    1.3 质粒 pBAD/ gIIIA 的制备  38-39
    1.4 PcRab7 基因的扩增  39
    1.5 表达载体 pBAD/ gIIIA-pcrab7 的构建  39-41
    1.6 PcRab7 的诱导表达、鉴定及纯化  41-44
    1.7 重组 PcRab7 蛋白的 Bradford 法定量  44-45
    1.8 PcRab7 多克隆抗体的制备  45
  2 结果  45-49
    2.1 pBAD/ gIIIA 质粒与 PcRab7 目的片段的制备  45-46
    2.2 表达载体 pBAD/ gIIIA-pcrab7 的构建  46-47
    2.3 pcrab7 基因表达产物分析  47-48
    2.4 重组蛋白 PcRab7 的纯化和复性  48
    2.5 纯化的重组 PcRab7 蛋白定量  48
    2.6 兔抗 PcRab7 多克隆抗体的制备  48-49
  3 讨论  49-50
第四章 中国对虾 Rab7 蛋白与 WSSV-VP28 的作用及结合位点的分析  50-79
  1 材料与方法  50-65
    1.1 菌种和蛋白  50-51
    1.2 实验用仪器和主要试剂  51
    1.3 VP28 基因的扩增  51-52
    1.4 重组表达载体 pBAD/ gIIIA-VP28 的构建  52-54
    1.5 VP28 的诱导表达、鉴定及纯化  54-55
    1.6 Dynabeads 磁珠结合法分析 PcRab7 蛋白与 VP28 蛋白的结合  55-56
    1.7 PcRab7 蛋白与 VP28 蛋白的具体作用区域的分析  56-65
  2 结果  65-77
    2.1 VP28 基因重组表达载体的构建  65-66
    2.2 VP28 基因表达产物分析  66-67
    2.3 重组蛋白 VP28 的纯化和复性  67
    2.4 Dynabeads 磁珠鉴定 VP28 与 PcRab7 蛋白的结合  67-68
    2.5 PcRab7 蛋白与 VP28 蛋白的具体作用位点  68-73
    2.6 PcRab7-2 蛋白与 VP28 蛋白的结合作用  73-77
  3 讨论  77-79
第五章 中国对虾 Rab7 与 WSSV-VP28 在中国对虾血淋巴细胞中的定位  79-87
  1 材料与方法  79-81
    1.1 实验动物  79
    1.2 实验用仪器和主要试剂  79-80
    1.3 抗体和蛋白的荧光标记  80
    1.4 中国对虾血淋巴细胞的培养  80
    1.5 免疫荧光细胞化学染色  80-81
    1.6 激光共聚焦显微镜观察  81
  2.结果  81-85
    2.1 PcRab7 在血淋巴细胞的定位  81-83
    2.2 PcRab7 与 VP28 在血淋巴细胞的共定位  83-85
  3.讨论  85-87
结论  87-88
参考文献  88-97
附录  97-100
致谢  100-101
攻读学位期间的科研成果  101

相似论文

  1. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  4. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  5. 携带WSSV凡纳滨对虾的养殖和环境因子胁迫的研究,S945
  6. 小麦黄花叶病毒（WYMV）RNA2编码基因的功能研究,S435.121
  7. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  8. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  9. 单细胞中光敏化单态氧的间接成像,Q2-3
  10. 棉花纤维初始发育期14-3-3相互作用蛋白的酵母双杂交筛选,S562
  11. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析,S852.65
  12. 猪细小病毒河南流行株的分离、鉴定及部分生物学特性研究,S852.65
  13. 转录因子在棉纤维起始期的表达特征及三个转录因子基因的克隆与功能初步分析,Q943
  14. 人源β-防御素-6的原核表达及纯化,Q78
  15. 圆眼珍珠蛙（Lepidobatrachus laevis）皮肤cDNA文库的构建、筛选及胰蛋白酶抑制剂的原核表达和活性研究,Q78
  16. 新型菊酯类农药降解酶的生化鉴定及分子改造研究,X172
  17. 棉铃虫与烟夜蛾寄主选择机制的比较研究,S435.622.3
  18. 玉米光周期敏感基因ZmELF4的克隆及功能验证,S513
  19. 小麦Na~+/H~+逆转运蛋白TaNHX2的功能验证及功能域分析,S512.1
  20. 碱蓬DREB同源基因的克隆与功能分析,Q943.2
  21. ABA诱导的OsDMI3基因的表达分析与亚细胞定位,S511

中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 甲壳类病虫害及其防治
© 2012 www.xueweilunwen.com