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草鱼呼肠孤病毒诱导FHM细胞凋亡及表达VP6蛋白重组杆状病毒的构建

作　者: 黎琴
导　师: 刘学芹
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 草鱼呼肠孤病毒 细胞凋亡 重组杆状病毒 疫苗
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp reo virus, GCRV)是由我国分离鉴定的第一株鱼类病毒,也是目前水生呼肠孤病毒属中致病力最强的病毒之一,该病毒不仅感染草鱼,而且还可以感染鲢鱼、布氏鳌条鱼,给水产养殖业带来了严重的经济损失。本研究围绕GCRV诱导细胞凋亡和杆状病毒载体疫苗两个方面展开了以下研究：1. GCRV诱导FHM细胞凋亡的初步研究将GCRV分别感染草鱼肾细胞(Ctenopharyngodon idellus kidney cell, CIK)和胖头鲤细胞(Fathead minnow cell, FHM),在不同时间点观察细胞病变效应,发现GCRV均可引起这两种细胞病变,但发生病变的细胞在形态上有所不同,GCRV对CIK细胞更为敏感,可以使感染的CIK细胞快速融合并裂解,而被感染的FHM细胞很少有细胞融合,并且细胞不会被裂解：利用DAPI、Annexin V-FITC染色和TUNEL技术进一步证实GCRV能够诱导FHM细胞发生细胞凋亡,但不能诱导CIK细胞发生细胞凋亡。本研究首次发现GCRV可以诱导FHM细胞发生凋亡,并推测GCRV在感染不同类型的细胞时,可以以不同机制促使细胞死亡,从而为进一步研究GCRV的致病机制提供线索。2.表达GCRVVP6蛋白的重组杆状病毒构建及其诱导草鱼免疫反应的评价克隆GCRV VP6基因,并将其插入杆状病毒转移质粒,构建重组转移质粒pFast-CMV-VP6,将其转化至感受态细胞DH10Bac后,经过多次筛选及纯化,获得阳性重组子rBacmid-CMV-VP6;将重组子在脂质体介导下转染昆虫细胞sf9,最后获得重组杆状病毒Bac-CMV-VP6;将重组杆状病毒Bac-CMV-VP6感染sf9、EPC和CIK细胞,通过间接免疫荧光检测,证明VP6蛋白均可以在这三种细胞中进行表达；将该重组杆状病毒免疫10-15cm草鱼,剂量为109PFU/条,并在免疫后第7d、14d、21d采集免疫鱼的肝脏和脾脏,利用荧光定量PCR方法检测IFN-I、IRF-7基因表达情况；同时,在免疫后第28d,采集免疫鱼血清,并利用微量中和试验测定血清中的中和抗体水平,结果表明：该杆状病毒不仅可以增强草鱼IFN-I、IRF-7免疫相关基因的显著表达,而且可以诱导草鱼产生显著的中和抗体,从而为研究基于杆状病毒表达载体的GCRV新型基因工程疫苗奠定了基础。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-10
缩略语表  10-11
1 文献综述  11-22
  1.1 草鱼出血病  11
  1.2 草鱼呼肠孤病毒  11-13
    1.2.1 形态特征  12
    1.2.2 理化特征  12-13
  1.3 GCRV发病机理  13
  1.4 GCRV分子生物学  13-14
    1.4.1 GCRV基因编码的蛋白质  14
  1.5 GCRV的检测方法  14-16
    1.5.1 免疫学检测方法  15
    1.5.2 分子生物学检测方法  15-16
  1.6 草鱼出血病的防治  16-17
    1.6.1 传统疫苗  16
    1.6.2 重组亚单位疫苗  16-17
  1.7 杆状病毒表达系统  17-21
    1.7.1 杆状病毒表达载体概述  17-20
    1.7.2 杆状病毒表达载体的应用  20-21
  1.8 研究目的及意义  21-22
2 草鱼呼肠孤病毒诱导FHM细胞凋亡的初步研究  22-30
  2.1 引言  22-23
  2.2 实验材料  23
    2.2.1 细胞与毒株  23
    2.2.2 主要试剂  23
  2.3 实验方法  23-24
    2.3.1 细胞培养与病毒滴度的测定  23
    2.3.2 DAPI染色  23-24
    2.3.3 Annexin V-FITC染色  24
    2.3.4 TUNEL技术  24
  2.4 实验结果  24-28
    2.4.1 病毒感染CIK和FHM的细胞病变效应比较  24
    2.4.2 GCRV在CIK和FHM细胞中均能够有效增殖  24-26
    2.4.3 GCRV能够诱导FHM发生细胞凋亡  26-28
  2.5 讨论  28-29
  2.6 小结  29-30
3 表达草鱼呼肠孤病毒VP6基因的重组杆状病毒构建及其诱导草鱼免疫反应的评价  30-50
  3.1 引言  30-31
  3.2 实验材料  31-33
    3.2.1 质粒、细胞、菌株/毒株及动物  31
    3.2.2 主要试剂  31-32
    3.2.3 主要培养基  32
    3.2.4 主要缓冲液  32-33
  3.3 实验方法  33-42
    3.3.1 重组杆状病毒构建的流程  33-34
    3.3.2 引物设计  34
    3.3.3 RNA的提取  34-35
    3.3.4 RT-PCR  35
    3.3.5 PCR扩增VP6基因  35
    3.3.6 DNA片段的纯化回收  35-36
    3.3.7 重组转移质粒pFast-CMV-VP6的构建与鉴定  36
    3.3.8 转化  36-37
    3.3.9 质粒的小量制备  37
    3.3.10 重组质粒pFast-CMV-VP6的鉴定  37-38
    3.3.11 大肠杆菌感受态细胞DH10Bac的制备  38
    3.3.12 重组子rBacmid-CMV-VP6的构建鉴定  38-39
    3.3.13 重组Bacmid DNA的提取及鉴定  39
    3.3.14 重组杆状病毒Bac-CMV-VP6的获得  39-40
    3.3.15 重组杆状病毒的纯化及滴度的测定  40
    3.3.16 重组杆状病毒感染SF9细胞或转导EPC和CIK细胞  40-41
    3.3.17 间接免疫荧光实验检测VP6在昆虫细胞及鱼类细胞中的表达  41
    3.3.18 动物免疫实验  41
    3.3.19 免疫因子表达情况  41
    3.3.20 中和实验  41-42
  3.4 实验结果  42-47
    3.4.1 目的基因VP6的扩增  42
    3.4.2 重组质粒pFast-CMV-VP6的鉴定  42-43
    3.4.3 重组穿梭载体(Bacmid-CMV-VP6)的鉴定  43-44
    3.4.5 间接免疫荧光实验检测VP6蛋白在sf9、EPC和CIK细胞中的表达  44-45
    3.4.6 免疫相关基因IFN-I及IRF-7在肝脏与脾脏的表达情况  45-46
    3.4.7 中和实验  46-47
  3.5 讨论  47-49
  3.6 小结  49-50
结论  50-51
参考文献  51-62
致谢  62-63
附录  63

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
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