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鹿结核菌野毒株与卡介苗差异基因的原核表达及表达产物反应原性的初步研究

作　者: 于淼
导　师: 杜锐
学　校: 吉林农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鹿结核病卡介苗差异基因原核表达反应原性
分类号: S858.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 23次
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内容摘要

鹿结核病(Deer tuberculosis)是一种以鹿为主要感染动物的慢性、消耗性人畜共患传染病,在世界各地都有流行,其病原体主要是牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)。病理剖检显示感染病鹿的组织器官发生干酪样坏死、肉芽肿并形成结核病灶。全世界各个国家的鹿场都曾经检出过结核病原体或者曾发生过鹿结核病。1978年新西兰鹿场首先发现并确诊了鹿结核病,此后瑞典、美国、丹麦、加拿大、英国等国也陆续发现了鹿结核病。自20世纪80年代初东北鹿场首次发现鹿结核病以来,该病己成为威胁我国养鹿业健康发展的主要传染病之一。近些年,由于自然界中野生动物宿主的存在、人结核病的爆发流行及耐药分枝杆菌流行等原因,使鹿结核病发病率逐年上升,严重威胁我国养鹿业的健康发展。目前,在鹿结核病的防治问题上国内外尚无有效的方法,世界发达国家普遍采用的是“检疫—捕杀”政策,而鉴于鹿是珍贵的药用动物,我国兽医工作者仍然应用卡介苗(BCG)来预防鹿结核病。由于BCG为减毒的牛型结核分枝杆菌,且BCG本身存在一定的缺陷,机体接种BCG后产生的抗体会干扰结核菌素变态反应检测,而不同地区不同机体接种后免疫效果也不稳定。因此,人们尚无有效区分疫苗免疫动物与自然感染动物的方法。研究表明所有BCG菌株共缺失9个RDs(包含61个开放读码框),其中RD1区仅存在于致病性分枝杆菌中,在所有BCG菌株中缺失。而RD1区长期以来都被认为是结核分枝杆菌的主要毒力基因区,且该基因区编码的蛋白具有较强的免疫原性。因此,对鹿结核病野毒株和卡介苗差异基因RD1区的基因进行融合表达,分析其反应原性,筛选多个纯化的特异性抗原组成联合抗原,增加鹿结核血清学诊断的敏感性是近年来国内外的研究热点。现有研究表明,RD1区基因编码的抗原具有较强的特异性和敏感性,可作为鹿结核病血清学诊断的候选抗原,而融合基因所组成联合抗原的敏感性往往要高于单个抗原。因此,本试验应用PCR方法从已构建的鹿结核病野毒株与卡介苗差异基因文库中亚克隆获得RD1区的DTB-2、DTB-7、DTB-46、DTB-35目的基因,并应用重叠延伸剪切技术(即SOE法)将DTB-46、DTB-35进行基因融合。目的基因与克隆载体PMD-18-T Simple进行连接,经PCR鉴定、内切酶酶切分析、序列测定后的重组阳性克隆质粒与原核表达载体PGEX-4T-1连接并进行原核表达。通过SDS-PAGE和Western boltting对表达产物的反应原性进行初步研究。本实验拟筛选多个纯化的特异性抗原并将部分抗原组合成联合抗原,以期增加鹿结核血清学诊断的敏感性,为鹿结核病的诊断和综合防制奠定基础,对促进养鹿业的健康发展具有深远的意义。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-11
第一部分文献综述  11-20
  1 鹿结核病的概述  11
  2 流行病学概况  11-12
  3 致病机理  12-13
  4 鹿结核病的诊断进展  13-16
    4.1 尸体剖检  13
    4.2 病原学检查  13-14
    4.3 结核菌素皮内试验(TUBERCULIN TEST,TT)  14
    4.4 血清学诊断方法  14-15
    4.5 分子生物学诊断方法  15-16
  5 卡介苗在鹿结核中的防制中的应用情况  16-17
  6 鹿结核菌野毒株与卡介苗的差异基因  17-20
    6.1 鹿结核菌野毒株与卡介苗的差异基因  17
    6.2 鹿结核菌野毒株与卡介苗差异基因所编码的特异性蛋白  17-20
第二部分研究内容  20-48
  实验一鹿结核菌野毒株与卡介苗主要差异基因的亚克隆  20-32
    1 前言  20
    2 材料与方法  20-27
      2.1 材料  20-21
      2.2 方法  21-27
    3. 结果  27-30
      3.1 DTB-2、DTB-7、DTB-46、DTB-35基因的PCR扩增产物  27-28
      3.2 DTB-46、DTB-35融合基因的PCR扩增结果  28
      3.3 重组克隆的筛选及鉴定  28-29
      3.4 目的基因的序列测定与分析  29-30
    4. 讨论  30-31
      4.1 目的基因的来源  30
      4.2 目的基因的选择  30
      4.3 目的基因的融合  30-31
    5. 小结  31-32
  实验二鹿结核菌野毒株与卡介苗差异基因的原核表达  32-48
    1 前言  32
    2 材料与方法  32-41
      2.1 材料  32-34
      2.2 方法  34-41
    3 结果  41-46
      3.1 原核重组表达质粒的构建  41
      3.2 阳性重组表达质粒的鉴定  41-42
      3.3 SDS-PAGE分析  42-45
      3.4 WESTERN BLOTTING分析  45-46
    4 讨论  46-47
      4.1 表达体系的选择  46
      4.2 目的蛋白的纯化  46
      4.3 关于融合蛋白  46
      4.4 目的蛋白的活性  46-47
    5 小结  47-48
第三部分结论  48-49
参考文献  49-54
附录1  54-56
附录2  56-59
附录3  59-60
致谢  60-61
个人简历  61

鹿结核菌野毒株与卡介苗差异基因的原核表达及表达产物反应原性的初步研究

内容摘要

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