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棉籽蛋白发酵制备ACE抑制肽

作　者: 常通
导　师: 曹郁生
学　校: 南昌大学
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 棉籽蛋白发酵 ACE抑制肽分离纯化
分类号: TQ936.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

棉籽蛋白是一种重要的植物蛋白质资源,其氨基酸种类齐全,比例适当,价格低廉,是一种高质量的食物和饲料用蛋白。棉籽榨油得到的棉籽粕含有丰富的棉籽蛋白,但由于棉酚的存在,严重影响了棉籽蛋白的开发利用,仅有少量棉籽蛋白用于饲料添加。随着脱毒技术的发展和无毒棉的培育成功,给棉籽蛋白的应用开发提供了很好的发展前景。利用脱毒的棉籽蛋白制备有生理功能的活性多肽,用于保健食品和药品,不但对增进人类健康有着重要作用,也对延长棉花加工的产业链有着重要的意义。目前使用微生物发酵法制备棉籽蛋白ACE抑制肽的深入研究尚未见到详细报道。本论文以脱酚棉籽蛋白为原料,分离筛选高效安全的生产菌株,发酵制备ACE抑制肽,通过对发酵条件的优化,提高棉籽发酵液中ACE抑制肽的含量,最后使用超滤、凝胶层析和反相高效液相色谱对发酵液中的ACE抑制肽进行分离纯化,并鉴定ACE抑制肽的氨基酸序列,为棉籽蛋白的开发提供理论依据和技术支持。主要结果如下：1.从分离到的乳酸菌和芽孢杆菌中筛选出产蛋白酶的菌株,根据菌株对棉籽蛋白的水解能力以及发酵液的ACE抑制率,选择最适的发酵菌株。结果表明,从选用的泡菜汁中获得了4株乳酸菌,分别标记为L1～L4。通过观察这4株乳酸菌和枯草芽孢杆菌NCT314酪蛋白水解圈的有无可以发现,除了乳酸菌L3之外,其余4株菌都可以产生蛋白酶。将产蛋白酶的菌株接种到棉籽蛋白发酵培养基中进行发酵,检测结果表明,枯草芽孢杆菌NCT314发酵棉籽蛋白发酵液的水解度和ACE抑制率为最高,分别为18.36%和64.86%。因此选择枯草芽孢杆菌NCT314作为棉籽蛋白ACE抑制肽的发酵菌株。2.以脱酚棉籽蛋白为原料,以枯草芽孢杆菌NCT314为发酵菌,对其发酵条件进行了优化。首先以水解度和ACE抑制率为指标,进行了不同发酵时间(0、6、12、20、22、24、26、30、36、48、60 h)、不同发酵温度(27、30、32、35、37、40、42、47℃)、不同pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)和不同接种量(1%、3%、5%、7%、9%)的单因素试验,结果表明,当发酵时间为24 h,发酵温度为32℃,pH为7.0,接种量为5%时,棉籽蛋白发酵液ACE抑制肽的产量可达到最好。在单因素试验结果的基础上,以发酵液ACE抑制率为响应值,选取发酵温度、发酵时间和pH这三个影响显著的因素,设计响应面试验。通过响应面试验对以上发酵条件的优化,得到最佳发酵条件为：温度32.08℃、时间22.6 h、pH为7.2,若在此发酵条件下,发酵液的ACE抑制率最高可达78.06%。3.对发酵液中的ACE抑制肽进行了分离纯化。将棉籽蛋白发酵液中的ACE抑制肽经超滤、凝胶层析(Sephadex G-25)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化。结果表明,棉籽蛋白发酵液经超滤分离后可分为4个组分,分别是Ul(>30 kDa)、U2(30～10 kDa)、U3(10-5 kDa)和U4(<5 kDa)。其中,U4组分具有较强的ACE抑制能力,其IC50为0.94 mg/mL。U4组分经Sephadex G-25分离后可得到3个洗脱峰,分别标记为Sl、S2和S3。通过测定各洗脱峰的ACE抑制活性可知,组分S2的ACE抑制能力最强,IC50可达0.19mg/mL。使用制备型RP-HPLC可进一步将S2分成5个峰组分,分别编号为1-5号,收集各峰组分,经测定,4号峰组分具有较强的ACE抑制能力,其ACE抑制率可达83.77%。后经分析型RP-HPLC纯度鉴定,4号峰组分只含有一个肽段。最后,4号峰是一个由五个氨基酸连接成的肽段,其分子量为547.66,氨基酸序列为LPGVY(Leu-Pro-Gly-Val-Tyr)。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第1章前言  11-24
  1.1 肽  11-13
    1.1.1 肽的物理化学性质  11-12
    1.1.2 肽的吸收  12-13
    1.1.3 生物活性肽  13
  1.2 血管紧张素转化酶抑制肽  13-16
    1.2.1 血管紧张素转化酶  14
    1.2.2 ACE抑制肽的研究进展  14-15
    1.2.3 ACE抑制肽的作用机理  15
    1.2.4 ACE抑制肽抑制效果的评价  15-16
  1.3 ACE抑制肽的制备与分离纯化  16-21
    1.3.1 ACE抑制肽的制备方法  16-17
    1.3.2 ACE抑制肽的分离纯化方法  17-21
  1.4 棉籽蛋白活性肽的研究进展  21-24
    1.4.1 棉籽蛋白的营养成分  21-22
    1.4.2 影响棉籽蛋白品质的因素  22
    1.4.3 棉籽蛋白的应用现状  22-23
    1.4.4 研究的目的和意义  23-24
第2章用于水解棉籽蛋白的细菌的分离筛选  24-29
  2.1 前言  24
  2.2 材料试剂与仪器设备  24-25
    2.2.1 实验材料  24
    2.2.2 试剂  24-25
    2.2.3 仪器设备  25
  2.3 试验方法  25-26
    2.3.1 乳酸菌的分离  25
    2.3.2 乳酸菌的初步鉴定  25-26
    2.3.3 产蛋白酶菌株的筛选  26
    2.3.4 棉籽蛋白发酵液水解度的测定  26
    2.3.5 棉籽蛋白发酵液ACE抑制率的测定  26
  2.4 结果与分析  26-28
    2.4.1 乳酸菌的分离  26
    2.4.2 乳酸菌的初步鉴定  26-27
    2.4.3 产蛋白酶菌株的筛选  27
    2.4.4 棉籽蛋白发酵液水解度和ACE抑制率的测定结果  27-28
  2.5 小结  28-29
第3章棉籽蛋白发酵制备ACE抑制肽条件的优化  29-42
  3.1 前言  29
  3.2 材料试剂与仪器设备  29-30
    3.2.1 实验材料  29
    3.2.2 试剂  29-30
    3.2.3 仪器设备  30
  3.3 试验方法  30-32
    3.3.1 枯草芽孢杆菌NCT314的生长曲线  30
    3.3.2 发酵条件的单因素试验  30
    3.3.3 发酵条件响应面法优化设计  30-31
    3.3.4 发酵液水解度的测定  31
    3.3.5 ACE抑制率的测定  31-32
  3.4 结果与分析  32-41
    3.4.1 枯草芽孢杆菌NCT314生长曲线的绘制  32-33
    3.4.2 甘氨酸标准曲线的绘制  33
    3.4.3 不同发酵时间的影响  33-34
    3.4.4 不同发酵温度的影响  34-35
    3.4.5 不同pH的影响  35-36
    3.4.6 不同接种量的影响  36
    3.4.7 棉籽蛋白发酵条件的响应面试验分析  36-41
  3.5 小结  41-42
第4章棉籽蛋白ACE抑制肽的分离纯化  42-50
  4.1 前言  42
  4.2 材料试剂与仪器设备  42-43
    4.2.1 实验材料  42
    4.2.2 试剂  42-43
    4.2.3 仪器设备  43
  4.3 试验方法  43-45
    4.3.1 超滤技术分离纯化棉籽蛋白ACE抑制肽  43
    4.3.2 Sephadex G-25分离纯化棉籽蛋白ACE抑制肽  43
    4.3.3 制备型RP-HPLC分离纯化棉籽蛋白ACE抑制肽  43-44
    4.3.4 分析型RP-HPLC分离纯化棉籽蛋白ACE抑制肽  44
    4.3.5 不同组分ACE抑制活性的测定方法  44-45
    4.3.6 ACE抑制肚氨基酸序列的鉴定  45
  4.4 试验结果与分析  45-48
    4.4.1 不同超滤组分的ACE抑制能力  45
    4.4.2 经Sephadex G-25凝胶层析分离后各组分的ACE抑制力  45-46
    4.4.3 经RP-HPLC分离S2后各组分的ACE抑制活性  46-48
    4.4.4 棉籽蛋白ACE抑制肽氨基酸序列的分析  48
    4.4.5 棉籽蛋白ACE抑制肽的结构与其抑制ACE活性功能性质的探讨  48
  4.5 小结  48-50
第5章结论与展望  50-52
  5.1 结论  50-51
  5.2 研究的创新点  51
  5.3 建议  51-52
致谢  52-53
参考文献  53-60
附录 4号峰的电喷雾离子化质谱图  60-61
攻读学位期间的研究成果  61

棉籽蛋白发酵制备ACE抑制肽

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