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槐糖的提取纯化及其用于间型脉孢菌产纤维素酶的诱导研究

作　者: 邓晓鸿
导　师: 陈育如
学　校: 南京师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 间型脉孢菌纤维素酶槐糖诱导发酵
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本工作研究了间型脉孢菌(Neurospora intermedia)固体发酵产纤维素酶条件及酶学性质,以CMC酶、滤纸酶活力和β-葡萄糖苷酶为主要参考指标,结果表明：以麸皮米糠为碳源且比例为1：1,硫酸铵的浓度为3%,料液比为1：1.5时为最佳产酶培养基,在初始pH值为7.0,温度为34℃,培养时间为108h的条件下纤维素酶活力较高,CMC酶活、滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活值大小分别为668.0U/g、162.5U/g和939.5U/g,该微生物所产β-葡萄糖苷酶反应最适温度为55-60℃,最适pH值为4.5-5.0。得到固体酶制剂对葡萄糖和蔗糖有明显的水解及异构化作用。探索了绿色木霉和间型脉孢菌混合液体发酵产纤维素酶的规律,结果表明间型脉孢菌迟于绿色木霉菌24小时接种且接种量为1：1时为最优产酶组合,此时CMC酶活值最大为96.3U/mL,高于其它产酶形式组合和单一菌株条件。对于滤纸酶混合发酵相比于两种菌的单一发酵,其酶周期延迟了1天,其产酶的高峰为第5天,此时其酶活为22.8U/mL,峰值均大于单一发酵的峰值。对槐角中的黄酮类物质进行了初步分离提取,测得所提取的产品中总黄酮和总异黄酮含量分别为61.3%和21.6%；测得槐角中槐糖(以干重计)的含量为0.52%,采用LC-MS技术初步鉴定出了山奈酚、槐角苷、染料木苷和染料木素。研究了从甜菊苷中提取与纯化槐糖。以槐糖水解得率为目的,采用正交实验优化水解条件得到槐糖最佳酸水解条件为：粗品浓度为1%,硫酸浓度为0.3N,提取时间为60min.此条件下槐糖水解得率可达34.1%。用活性炭柱层析对甜菊苷水解液进行了槐糖的分离与纯化,目标产物经LC-MS鉴定为高纯度槐糖。探索了槐糖对间型脉孢菌产纤维素酶的诱导作用。在以含槐糖(10-2M)的诱导液为碳源时,菌丝体到达酶活高峰值的诱导时间为24小时,此时CMC酶活为46.3U/mL。在脉孢菌的培养过程中,加诱导物的时间切入点影响槐糖浓度对产酶的正诱导效果；第3小时测定时,随着槐糖浓度递度升高CMC酶值几乎无变化且处在一个较低水平。第18和24小时测定时,酶活值随槐糖浓度的增大而提高,槐糖浓度为10-1M时,其酶活最大值分别为24.7U/mL和68.0U/mL。可见在只有在一定条件,脉孢菌产CMC酶的能力在条件下随着诱导槐糖浓度的提高而加强。在控索菌丝体与诱导液持续接触的时间长短对随后酶活值增长的影响时,结果表明：第6、12、18时中途洗去诱导液,它们在第24小时的酶活峰值分别为对照值的22.1%、43.4%和63.7%。

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摘要 3-4Abstract 4-10第一章文献综述 10-21 1.1 纤维素及纤维素酶的概述 10-15 1.1.1 纤维素资源利用现状及研究意义 10 1.1.2 植物槐角的概况 10-11 1.1.3 甜叶菊概况 11 1.1.4 纤维素的分子结构特征 11-12 1.1.5 纤维素酶酶系组成及纤维素的降解机理 12-13 1.1.6 纤维素酶的理化性质 13-14 1.1.7 产纤维素酶的微生物 14-15 1.2 纤维素酶的生产 15-19 1.2.1 固、液发酵生产纤维素酶 15 1.2.2 混合菌发酵生产纤维素酶 15-16 1.2.3 与微生物发酵产纤维素酶相关的糖基转移酶 16-17 1.2.4 纤维素酶的诱导与调控 17-19 1.2.4.1 产纤维素酶的诱导源 17-18 1.2.4.2 调控过程 18-19 1.2.5 发酵生产纤维素酶条件的优化 19 1.2.6 纤维素酶活力测定 19 1.3 纤维素酶的应用 19-20 1.4 本工作的研究内容 20-21第二章间型脉孢菌固体发酵产纤维素酶 21-32 2.1 材料与方法 21-23 2.1.1 菌种 21 2.1.2 仪器设备 21 2.1.3 培养基 21 2.1.4 发酵方法 21-22 2.1.4.1 孢子悬液的制备 22 2.1.4.2 固体产酶培养 22 2.1.4.3 酶促转苷反应培养 22 2.1.5 粗酶的制备及酶活力测定方法 22-23 2.1.6 固体发酵培养基正交优化试验 23 2.1.7 产酶条件的优化 23 2.2 实验结果与分析 23-30 2.2.1 产酶培养基的正交优化试验结果 23-25 2.2.2 培养基初始pH值对固体发酵产酶的影响 25 2.2.3 培养温度对固体发酵产酶的影响 25-26 2.2.4 β-葡萄糖苷酶酶学特性 26-28 2.2.4.1 酶反应的最适温度 26 2.2.4.2 酶的热稳定性 26-27 2.2.4.3 酶反应的最适pH值 27 2.2.4.4 酶的pH稳定性 27-28 2.2.5 不同微生物产纤维素酶的比较 28 2.2.6 固体曲用于酶促转苷反应 28-30 2.2.6.1 脉孢菌固体曲对葡萄糖的转化作用 28-29 2.2.6.2 脉孢菌固体曲对蔗糖的转化作用 29-30 2.2.6.3 青霉菌固体曲对蔗糖的转化作用 30 2.3 本章小结 30-32第三章绿色木霉与间型脉孢菌混合液体发酵产纤维素酶 32-39 3.1 材料与方法 32-34 3.1.1 菌种 32 3.1.2 试剂与仪器 32 3.1.3 培养基 32-33 3.1.4 发酵方法 33 3.1.4.1 孢子悬液的制备 33 3.1.4.2 种子及产酶培养 33 3.1.5 粗酶的制备及酶活力测定 33-34 3.1.5.1 粗酶液的制备 33 3.1.5.2 CMC酶活力的测定 33 3.1.5.3 滤纸酶活力测定 33-34 3.2 实验结果与分析 34-37 3.2.1 时间对绿色木霉发酵产纤维素酶的影响 34 3.2.2 时间对间型脉孢菌发酵产纤维素酶的影响 34-35 3.2.3 不同产酶形式组合的结果对比 35 3.2.4 混合发酵产纤维素酶与单一菌种产酶的比较 35-37 3.3 本章小结 37-39第四章槐角中槐糖与黄酮类物质含量的测定与提取 39-45 4.1 材料与方法 39-40 4.1.1 原料 39 4.1.2 试剂与仪器 39-40 4.1.3 分析方法 40 4.1.3.1 槐糖分析 40 4.1.3.2 黄酮类物质分析 40 4.2 实验结果与讨论 40-44 4.2.1 总黄酮含量的测定法 40-41 4.2.2 总异黄酮含量测定方法 41-42 4.2.3 槐糖含量的测定 42-44 4.3 本章小节 44-45第五章甜菊苷中槐糖的提取与纯化 45-53 5.1 材料与方法 45-46 5.1.1 原料 45 5.1.2 水解方法 45 5.1.3 试剂与仪器 45-46 5.1.4 分析方法 46 5.2 实验结果与分析 46-52 5.2.1 水解单因素试验 46-49 5.2.1.1 糖浓度对槐糖水解得率的影响 46-47 5.2.1.2 两种酸对槐糖水解得率的影响 47-48 5.2.1.3 水解时间对槐糖水解得率的影响 48 5.2.1.4 酸浓度对槐糖水解得率的影响 48-49 5.2.2 适宜水解条件的确定 49-50 5.2.3 槐糖的纯化 50-51 5.2.4 槐糖的LC-MS图谱分析 51-52 5.3 本章小结 52-53第六章槐糖用于间型脉孢菌发酵产纤维素酶的研究 53-60 6.1 材料与方法 53-54 6.1.1 菌种与材料 53 6.1.2 试剂与仪器 53 6.1.3 培养基 53-54 6.1.4 生长培养 54 6.1.5 菌丝洗涤诱导 54 6.1.6 酶活力测定 54 6.2 实验结果与分析 54-59 6.2.1 间型脉孢菌菌丝体诱导产酶过程的确定 54-55 6.2.2 不同时间点的槐糖浓度对菌丝体诱导产纤维素酶的影响 55-56 6.2.3 诱导中途洗去槐糖对菌丝体产纤维素酶的影响 56-57 6.2.4 各种纤维性碳源对产酶的影响 57-58 6.2.5 诱导物对不同微生物产纤维素酶的情况比较 58-59 6.3 本章小结 59-60第七章总结与展望 60-62 7.1 总结 60-61 7.2 展望 61-62附录 62-63参考文献 63-72论文 72-73致谢 73

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