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超声辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽的研究

作　者: 韩扬
导　师: 董银卯；王昌涛
学　校: 北京工商大学
专　业: 生物化工
关键词: 燕麦 ACE抑制肽超声波辅助酶解响应面分析法纯化分离理化性质分析
分类号: TQ464.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

燕麦作为传统的保健食品,凭借其富含的多种营养物质,如蛋白质,可溶性膳食纤维,维生素及矿物质,及其良好的保健功效,在国内外已经展现出良好的市场前景。燕麦蛋白的氨基酸组成均衡,是非常好的植物源生物活性肽来源,开发燕麦生物活性肽对于促进我国乃至世界范围内燕麦资源发展有着十分重要的意义。高血压是一种以动脉血压升高为主要症状,并可引发心、脑、肾、视网膜等靶器官损伤及代谢改变的临床综合症。据统计,全世界每年因高血压引起的心脑血管疾病的死亡人数超1200万,高血压病已成为全球性的重大的公共卫生问题。研究表明,抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性对降低血压有积极的作用,因此,研究开发有效的ACE抑制剂引起人们极大的关注。食物源ACE抑制肽具有安全性高,毒副作用小,易吸收等特点,有着合成化学药物不可比拟的优越性,成为抗高血压功能性食品研究的热点之一。超声波作为一种物理能量形式,广泛用于医学、工业、化学和化工过程、环境保护、食品工业、生物工程等方面。当前,超声波的应用越来越受到人们的重视,其涉及领域也随之不断拓展。本研究利用超声辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽,探讨各蛋白酶水解燕麦蛋白的最佳条件,以对血管紧张素转化酶抑制作用和水解度为指标,研究最佳酶解工艺;并对燕麦蛋白酶解产物进行分离纯化,再根据不同分子量燕麦水解产物对血管紧张素转化酶抑制作用的研究,筛选有降血压活性的燕麦多肽,具有广阔的研究价值和应用前景。研究结果如下:1、研究了超声波辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽的工艺条件,首先确定了超声波辅助酶法比传统方法在制备ACE抑制肽的优势;经过单因素实验初步确定了反应条件,即反应容器:塑料杯;酶:Alcalase酶(Novo);预处理pH值:11;超声波处理时间:30min;超声波频率:50kHz;超声波功率:176W;超声波水浴温度:55℃;水料比:10:1;酶解时间:2h;加酶量:5%。接着采用响应面设计实验,运用根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理,选择对ACE抑制率有显著影响的四个因素:超声波处理时间(X1)、超声波功率(X2)、超声波水浴温度(X3)和酶解时间(X4),以对血管紧张素转化酶抑制作用为指标,做4因素3水平的响应面分析实验。最终得到超声波处理时间28.40min;超声波功率190.08W;超声波水浴温度55.05℃;酶解时间2.25h。2、实验筛选大孔吸附树脂对燕麦酶解液进行纯化,验证了树脂较好的脱糖脱盐效果,且同样多肽浓度下,纯化后产物的ACE抑制率高于纯化前产物;对纯化前后产物的氨基酸成分进行分析,纯化后燕麦ACE抑制肽的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和支链氨基酸残基含量均高于纯化前酶解产物,从氨基酸含量上证明了纯化后ACE抑制肽的ACE抑制活性高于纯化前酶解产物;应用HPLC对纯化后ACE抑制肽的分子量分布状态进行测定,纯化后产物分子量分布在240.10~1292.11Da之间,全部小于1500Da,是较好的后续分离多肽源。3、利用葡聚糖凝胶对纯化后燕麦ACE抑制肽进行分离,实验得到了SephadexG-15分离燕麦ACE抑制肽时的最优条件,样品浓度:100 mg/mL;上样量:3mL;流速:0.6 mL/min;洗脱剂:蒸馏水。应用以上条件得到了五个分离组分,通过对这五个组分ACE抑制率的测定,得到D峰的抑制率最高,IC50为0.103mg/ml,其分子量为545,根据氨基酸平均分子量可知约有3或4个氨基酸组成;通过对其稳定性进行考察可知,组分峰D有较好的pH值和温度稳定性;此外,应用胃蛋白酶+胰蛋白酶的处理方式进行体外消化实验,ACE抑制肽(D组分峰)在经过消化酶处理后仍能维持很高的ACE抑制活性,加大了这种燕麦来源的ACE抑制肽在胃肠道中吸收进入血液循环的可能性,口服这种活性肽有可能在人体内发挥较好的降血压作用。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
第一章文献综述  12-28
  1 燕麦简介  12-15
    1.1 我国燕麦的分布状况  12
    1.2 燕麦中营养物质及含量  12-13
    1.3 燕麦的保健作用  13-15
      1.3.1 降低胆固醇  14
      1.3.2 防癌作用  14
      1.3.3 抗氧化作用  14
      1.3.4 抗高血粘度和血小板聚集作用  14
      1.3.5 降血糖  14-15
      1.3.6 减肥  15
  2 ACE 抑制肽的研究  15-22
    2.1 高血压  15-16
      2.1.1 高血压的分类及标准  15-16
      2.1.2 高血压的危害  16
    2.2 血管紧张素转换酶(ACE)与高血压的关系  16-18
      2.2.1 ACE 概述  16-17
      2.2.2 ACE 在血压调节中的作用  17-18
    2.3 生物活性肽  18-22
      2.3.1 ACE 抑制肽概述  19
      2.3.2 ACE 抑制肽的吸收性  19-20
      2.3.3 ACE 抑制肽的抑制机理  20
      2.3.4 ACE 抑制肽的制取方法与食物来源  20-21
      2.3.5 ACE 活性检测方法  21-22
  3 超声化学  22-28
    3.1 超声化学的基本原理  23-24
    3.2 超声波作用机理  24-25
    3.3 超声化学的应用  25-28
      3.3.1 有机合成  25
      3.3.2 高分子的降解和聚合  25
      3.3.3 催化  25
      3.3.4 电化学  25
      3.3.5 提取与分离  25-26
      3.3.6 超声波对酶解过程促进作用的研究  26-28
第二章超声辅助酶法制备燕麦ACE 抑制肽  28-53
  1 前言  28
  2 材料与方法  28-35
    2.1 实验材料与主要试剂  28-29
      2.1.1 实验原料  28-29
      2.1.2 主要试剂  29
    2.2 主要仪器  29-30
    2.3 实验方法  30-35
      2.3.1 超声波辅助酶法制备燕麦ACE 抑制肽的优势  30
      2.3.2 超声波辅助酶法制备燕麦ACE 抑制肽单因素实验  30
      2.3.3 超声波辅助酶解响应面(RSM)因素的确定  30
      2.3.4 检测方法  30-35
  3 结果与分析  35-52
    3.1 超声波辅助酶法制备燕麦ACE 抑制肽的优势  35-37
    3.2 超声波辅助酶法制备燕麦ACE 抑制肽单因素实验  37-46
      3.2.1 超声波容器的选择  38-39
      3.2.2 不同蛋白酶的选择  39
      3.2.3 预处理pH 值的选择  39-41
      3.2.4 超声波处理时间的选择  41
      3.2.5 超声波频率的选择  41-42
      3.2.6 超声波功率的选择  42-43
      3.2.7 超声波水浴温度的选择  43-44
      3.2.8 料水比的选择  44-45
      3.2.9 酶解时间的选择  45
      3.2.10 加酶量的选择  45-46
    3.3 响应面法分析超声波辅助酶法的最佳制备工艺  46-52
      3.3.1 以ACE 抑制率为响应值酶解-响应面(RSM)因素的确定  46-47
      3.3.2 以ACE 抑制率为响应值的工艺参数的优化  47-48
      3.3.3 回归方程的方差分析  48-49
      3.3.4 响应曲面及等高线图分析  49-52
  4 本章小结  52-53
第三章燕麦ACE 抑制肽的纯化及纯化产物理化性质的研究  53-70
  1 前言  53
  2 材料与方法  53-58
    2.1 实验材料  53
    2.2 主要试剂  53-54
    2.3 主要仪器  54
    2.4 实验方法  54-58
      2.4.1 燕麦酶解产物的制备方法  54
      2.4.2 大孔吸附树脂纯化燕麦ACE 抑制肽的研究  54-55
      2.4.3 利用高效液相色谱仪精确测定燕麦多肽分子量  55-57
      2.4.4 样品检测方法  57-58
  3 结果与分析  58-68
    3.1 燕麦ACE 抑制肽的制备  58
    3.2 树脂的筛选  58-61
      3.2.1 大孔吸附树脂DA201-C 静态吸附实验  58-59
      3.2.2 大孔吸附树脂XAD1600 静态吸附实验  59
      3.2.3 大孔吸附树脂XAD7HP 静态吸附实验  59-60
      3.2.4 三种树脂静态吸附实验吸附性能的比较  60
      3.2.5 静态吸附实验研究酶解液的pH 值对动态吸附率的影响  60-61
    3.3 纯化用燕麦ACE 抑制肽工艺的研究  61-68
      3.3.1 未进行预处理酶解液动态吸附及解吸实验  61-63
      3.3.2 对纯化前酶解液进行预处理后动态吸附及解吸实验  63-68
  4 本章小结  68-70
第四章凝胶层析分离燕麦ACE 抑制肽及分离组分的性质分析  70-81
  1 前言  70
  2 材料与方法  70-73
    2.1 实验材料与主要试剂  70
    2.2 主要仪器  70
    2.3 实验方法  70-73
      2.3.1 凝胶的筛选  70-71
      2.3.2 凝胶色谱分析法测燕麦肽的分子量分布状态  71-72
      2.3.3 凝胶层析分离条件的优化  72
      2.3.4 ACE 抑制活性的测定  72
      2.3.5 利用高效液相色谱仪精确测定组分峰分子量  72
      2.3.6 ACE 抑制肽的性质分析  72-73
  3 结果与分析  73-79
    3.1 SephadexG-15 分离ACE 抑制肽  73-76
      3.1.1 洗脱剂对SephadexG-15 分离ACE 抑制肽的影响  74-75
      3.1.2 样品浓度对SephadexG-15 分离ACE 抑制肽的影响  75-76
    3.2 凝胶分离组分的ACE 抑制活性  76-77
    3.3 ACE 活性抑制肽性质分析  77-79
      3.3.1 ACE 抑制肽的pH 值稳定性  77-78
      3.3.2 ACE 抑制肽的温度稳定性  78
      3.3.3 ACE 抑制肽的体外消化实验  78-79
  4 本章小结  79-81
第五章结论与展望  81-83
  1 课题的创新之处  81
  2 本课题的研究结论  81
  3 前景展望  81-83
参考文献  83-87
硕士生期间发表的学术论文与研究成果  87-88
致谢  88

超声辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽的研究

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