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鸡源抗菌肽Fowlicidin-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性研究

作　者: 李荣荣
导　师: 鲍恩东; 陈溥言
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 抗菌肽Fowlicidin-3 毕赤酵母 分泌表达 生物活性
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


众所周知,抗生素作为治疗病原感染的有力武器,在人类医疗领域以及畜牧业中都占有重要的地位。但是,抗生素的滥用也给病原菌和环境微生物造成很大选择压力,并由此而诱导产生出具有多种抗生素抗性的微生物菌株,同时由于新型抗生素的开发很耗时,抗生素的应用往往也无法跟上耐药菌株产生的速度,给人类以及畜禽健康带来严重危机,这也使得人们对安全、有效的新型抗菌制剂的寻求更为迫切。抗菌肽作为动物免疫防御系统的一个重要组成部分,这类多肽具有杀菌谱广、作用机制独特、热稳定性高等优点。鉴于以上优点,抗菌肽成为具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。本研究的目的就是应用基因工程和蛋白质工程技术研制出鸡源Fowlicidin-3重组抗菌肽,并研究其体内外抗菌活性,为重组抗菌肽的工程化生产及其在临床上的应用奠定基础。本研究主要从以下几个方面展开。1根据抗菌肽数据库中Fowlicidin-3的氨基酸序列,选用毕赤酵母的偏嗜密码子,设计抗菌肽的基因,通过SOE法合成得到全长为114 bp的Fowlicidin-3基因。将Fowlicidin-3基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-F。将线性化重组表达载体pPICZα-A-F转入毕赤酵母宿主菌X-33中,获得分泌表达量达到150mg/L的Fowlicidin-3多肽,对致病性大肠杆菌K99和鸡白痢沙门氏菌显示出较好的抑制活性,抑菌圈直径分别为1.9 cm和2.2 cm。2本试验选用X-33毕赤酵母菌株表达鸡源Fowlicidin-3抗菌肽,对表达条件进行优化并进行表达产物的生物学活性研究。结果表明,当含有重组酵母菌的BMGY培养基的OD600达到5-6时,转接pH 6.0的BMMY培养基,每24h补加2%甲醇,29℃条件下培养72h后,鸡源Fowlicidin-3抗菌肽获得高效表达,含量达到170 mg/L。采用琼脂孔扩散法对该抗菌肽的热稳定性、酸碱稳定性等生物学活性进行分析,结果表明鸡源Fowlicidin-3抗菌肽具有较强的热、酸稳定性；对致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别达到3.12μg/mL、1.56μg/mL和1.56μg/mL.3为比较研究重组Fowlicidin-3抗菌肽对大肠杆菌感染鸡的体外疗效,本试验以21日龄AA肉雏鸡作为研究对象,利用重组Fowlicidin-3抗菌肽对大肠杆菌感染雏鸡进行体外保护及治疗试验。试验结果显示,保护性实验中,Fowlicidin-3上清组、环丙沙星组与感染对照组相比,死亡率显著降低,且Fowlicidin-3上清组保护与防病效果与环丙沙星效果相当；治疗性实验中,抗菌肽上清治疗组、环丙沙星治疗组与感染对照组相比死亡率显著降低,并且抗菌肽Fowlicidin-3上清组对大肠杆菌病有较好的体内治疗效果,与抗生素环丙沙星显示的效果相当。

全文目录


中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
氨基酸及其缩写  9-10
第一篇 文献综述  10-34
  第一章 抗菌肽研究进展  12-34
    1 抗菌肽概述  12-18
    2 鸡源性抗菌肽Fowlicidins的研究进展  18-20
    3 抗菌肽的毕赤酵母表达策略  20-23
    4 抗菌肽的应用前景及存在的问题  23-28
    参考文献  28-34
第二篇 试验部分  34-66
  第二章 鸡源Fowlicidin-3重组抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达及其生物学活性的初步检测  36-48
    1 材料与方法  37-42
    2 结果  42-44
    3 讨论  44-46
    参考文献  46-48
  第三章 鸡源Fowlicidin-3重组抗菌肽表达条件的优化及其生物学特性  48-58
    1 材料与方法  49-51
    2 结果  51-54
    3. 讨论  54-56
    参考文献  56-58
  第四章 鸡源Fowlicidin-3重组抗菌肽对大肠杆菌感染雏鸡的体外疗效试验  58-66
    1 材料与方法  58-61
    2 结果  61-62
    3 讨论  62-64
    参考文献  64-66
全文总结  66-68
致谢  68-70
附录  70-73

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学
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