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软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在毕赤酵母和枯草杆菌中的表达

作　者: 张佳瑜
导　师: 吴敬
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: α-环糊精葡萄糖基转移酶毕赤酵母枯草杆菌表达发酵优化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

环糊精葡萄糖基转移酶,简称CGT酶,它能够通过转葡糖苷作用催化低聚糖生成偶合糖,通过糖基化反应对甜菊苷进行改性,还可以通过环化反应利用淀粉催化得到环糊精,由于上述物质独有的特性和特有的用途,使得它们在食品等领域的应用逐渐推广。本实验室前期工作中已对来源于软化芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)JFB05-0 1的a-CGT酶在大肠杆菌中的表达进行了广泛的研究。本研究从食品安全生产为出发点,尝试从毕赤酵母和枯草杆菌这两种工业上广泛使用的宿主菌入手,研究软化芽孢杆菌a-CGT酶在重组毕赤酵母(Pichia pastoris)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)中的表达,并通过一系列发酵条件优化,旨在不断提高重组酶的表达量。主要研究结果如下：(1)将来源于软化芽孢杆菌的a-CGT酶基因插入毕赤酵母表达载体pPIC9K的信号肽下游,构建了重组质粒pPCGT,将其转化P. pastoris YM71,获得了产a-CGT酶的基因工程菌P. pastoris KM71/pPCGT,但是经摇瓶培养96h后,胞外酶活仅0.2 U/mL,SDS-PAGE未检测到目的蛋白条带。从密码子偏爱性和糖基化角度对CGT酶在毕赤酵母中表达量低的原因进行了深入的分析,发现毕赤酵母极低频率使用密码子在cgt基因中所占比例为8%,同时该酶中存在9个潜在的糖基化位点,密码子不偏爱以及潜在的糖基化可能会影响CGT酶在毕赤酵母中的表达。(2)将a-CGT酶基因插入枯草杆菌组成型载体pMA5的信号肽下游,构建重组质粒pMCGT,转化B. subtilis WB600进行表达,摇瓶培养36 h后重组B. subtilis WB600/pMCGT胞外酶活力为1.9 U/mL,而阴性对照WB600/pMA5检测不到酶活,且SDS-PAGE表明细胞内没有包涵体。对重组菌株进行初步摇瓶优化,确定较优条件为：初始培养基为TB,温度37℃,初始pH为7,最佳接种量4%,在该条件下,胞外酶活达到4.3 U/mL。(3)将a-CGT酶基因连接枯草杆菌诱导型载体pGJ103后转化B. subtilis WB600,获得了胞外分泌表达P. macerans a-CGT酶的重组B. subtilis WB600/pGCGT菌株,在1%的麦芽糖初始发酵培养基上摇瓶培养,48 h后重组枯草杆菌产酶活性为5.1 U/mL。与重组B. subtilis WB600/pMCGT相比,胞外酶活较高,并且目的蛋白也都分泌到了胞外。考察了该诱导型菌株的种子生长情况,对数生长期为4至12小时,8小时为最佳种龄,另外考察了菌株稳定性,传代5代后质粒保持率在92%以上。(4)对重组B. subtilis WB600/pGCGT菌株进行了摇瓶条件优化。通过单因素实验优化得到诱导剂麦芽糖的最佳浓度为15g/L,最适碳、氮源分别为玉米淀粉和酵母粉,采用Box-Behnken实验设计和响应面方法考察了三者配比的最佳浓度,最终确定了发酵培养基组分为麦芽糖15.5 g/L,玉米淀粉13g/L,酵母粉20 g/L,蛋白胨4 g/L,硝酸钠2 g/L,K2HPO412.4 g/L, KH2PO42.3 g/L。在此优化条件下,摇瓶a-CGT酶的酶活为17.6 U/mL。(5)对重组B. subtilis/pGCGT在5 L罐中的发酵工艺进行初步研究。通过分批发酵实验确定细胞生长和a-CGT酶合成所需溶氧为20%。在分批发酵的基础上,初步尝试了分批补加蔗糖对重组B. subtilis产α-CGT酶的影响,补加25 g/L蔗糖,诱导培养35 h后菌体干重最大达到15.5 g/L,最终α-CGT酶产量为30 U/mL。

软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在毕赤酵母和枯草杆菌中的表达

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