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槐猪精液NAGase的酶学性质与活力调控

作　者: 章文
导　师: 黄小红
学　校: 福建农林大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 槐猪精液 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶分离纯化酶学性质活力调控
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

以福建省地方品种槐猪精液为提酶材料，采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-32阴离子交换柱、Sephadex G-200分子筛柱和CM Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析，纯化获得聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳单一纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）纯酶制剂，比活力为2759.15U mg^-1，回收率为7.88%。该酶等电点为8.9，经凝胶柱层析和SDS-PAGE测得酶分子量为71kDa，且只含有一个亚基。酶水解对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（pNP-GlcNAc）的最适pH为5.7，最适温度为50℃，米氏常数Km和最大反应速度Vm分别为0.80mmol L^-1和25.16μmol L^-1 min^-1。而酶水解P-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷（pNP-GalNAc）的最适pH为5.6，最适温度为55℃，米氏常数Km和最大反应速度Vm分别为0.24mmol L^-1和3.68μmol L^-1 min^-1。酶在50℃以下，pH3.0-8.6范围内保持稳定。酶催化水解pNP-GlcNAc的活化能Ea为69.09kJ mol^-1。以动力学方法和化学修饰法研究酶活性中心功能基团的性质。在37℃下测得NAGase活性中心解离常数pKe为5.29；解离热焓ΔHo为7.28kcal mol^-1，结果表明与酶活性相关的可解离基团是组氨酸的咪唑基。酶在特定条件下通过修饰剂作用，测得酶分子链内二硫键、半胱氨酸的巯基、色氨酸的吲哚基及赖氨酸的ε-氨基也是酶活性中心的必需基团，而精氨酸的胍基与酶活性无关。酶催化pNP-GlcNAc的水解反应属于双底物双产物反应，研究产物的抑制动力学，根据Cleland规则探讨酶的催化作用机理，结果表明第一产物NAG表现为混合型抑制，而第二产物pNP类似物苯酚对酶没有影响，酶催化反应属于有序双双机理。研究精清成分对NAGase的影响，结果表明：Na⁺、K⁺、Cl^-及低浓度的果糖对酶活力没有影响；HCO₃^-、PO₄^3-、碱性氨基酸、维生素B1和高浓度的果糖对酶活力有不同程度的抑制作用；柠檬酸对酶活力表现出先激活后抑制作用；而维生素C对酶活力则有显著的激活作用。进一步研究其作用机理，表明碱性氨基酸Lys、Arg、His和HCO-3为竞争型抑制，其抑制常数KI分别为16.92mmol L^-1、28.13mmol L^-1、77.43mmol L^-1和48.54mmol L^-1；果糖为混合型抑制，其抑制常数KI和KIS分别为0.89mol L^-1和0.43mol L^-1；PO3-4和柠檬酸为非竞争型抑制，其抑制常数KI分别为31.48mmol L^-1和63.58mmol L^-1；维生素B1为反竞争型抑制，其抑制常数KIS为1.69mmol L^-1；而维生素C则表现为部分竞争性激活。研究微量元素对NAGase的影响，结果表明：Mn2+、Co2+及I-在低浓度下对酶活力有轻微的激活作用； Fe²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Cr³⁺及高浓度的Mn²⁺对酶活力有明显的抑制作用，其抑制程度依次为Cr³⁺> Cu²⁺> Fe²⁺> Zn²⁺> Mn²⁺；而亚硒酸钠对酶活力表现出先激活后抑制作用。进一步测定其抑制类型和抑制常数，表明Cr³⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺及Mn²⁺均为反竞争型抑制，其抑制常数KIS分别为7.68μmol L^-1、0.11mmol L^-1、1.14mmol L^-1、3.15mmol L^-1和59.18mmol L^-1，而亚硒酸钠表现为混合型抑制，其抑制常数KI和KIS分别为0.15mmol L^-1和0.53mmol L^-1。本文还研究表明，在Cu²⁺和Zn²⁺存在下，均能降低酶的热稳定性，此外脱金属离子螯合剂（EDTA2Na）对酶有激活作用。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
缩写词  12-14
1 文献综述  14-22
  1.1 槐猪简介  14-16
    1.1.1 外貌形态  14
    1.1.2 种质特征  14-15
    1.1.3 养殖现状  15
    1.1.4 研究概况  15-16
  1.2 N-乙酰-Β-D-氨基葡萄糖苷酶研究概况  16-21
    1.2.1 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶简介  16-17
    1.2.2 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力测定  17
    1.2.3 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶生物学功能  17-18
    1.2.4 脊椎动物 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶研究现状  18-20
    1.2.5 糖蛋白在动物受精过程中的作用  20-21
  1.3 本论文的研究内容与研究意义  21-22
2 实验材料、仪器与方法  22-29
  2.1 材料与试剂  22
  2.2 仪器与设备  22-23
  2.3 方法  23-29
    2.3.1 蛋白含量测定  23
    2.3.2 酶活含量测定  23
    2.3.3 试剂处理  23
    2.3.4 酶的分离纯化  23-24
    2.3.5 酶的纯度鉴定  24
    2.3.6 酶的理化特性  24-25
    2.3.7 酶的催化动力学特性  25-26
    2.3.8 酶活性中心解离基团性质的研究  26
    2.3.9 酶活性中心必需基团的化学修饰  26-27
    2.3.10 产物与产物类似物对酶活力的影响  27
    2.3.11 精清成分对酶活力的影响  27-28
    2.3.12 微量元素对酶活力的影响  28-29
3 实验结果  29-61
  3.1 酶的分离纯化与纯度鉴定  29-31
  3.2 酶的理化特性  31-32
    3.2.1 酶的分子量与亚基数  31
    3.3.2 酶的等电点  31-32
  3.3 酶的催化动力学特性  32-35
    3.3.1 酶的最适 pH 与酸碱稳定性  32
    3.3.2 酶的最适温度与热稳定性  32-33
    3.3.3 酶催化水解反应的动力学参数  33-34
    3.3.4 酶催化 pNP-GlcNAc 水解反应的活化能  34-35
  3.4 酶活性中心解离基团的性质  35-37
    3.4.1 pH 对酶催化 pNP-GlcNAc 水解反应的效应  35
    3.4.2 酶活性中心的解离常数  35-37
    3.4.3 酶活性中心的解离热焓  37
  3.5 酶活性中心必需基团的化学修饰  37-39
    3.5.1 DTT 对酶的修饰作用  37-38
    3.5.2 PCMB 对酶的修饰作用  38
    3.5.3 NBS 对酶的修饰作用  38-39
    3.5.4 BrAc 对酶的修饰作用  39
    3.5.5 甲醛对酶的修饰作用  39
    3.5.6 乙酰丙酮对酶的修饰作用  39
  3.6 产物及产物类似物对酶活力的影响  39-41
    3.6.1 产物及产物类似物对酶活力的浓度效应  39-40
    3.6.2 NAG 对酶的抑制类型  40-41
    3.6.3 NAG 对酶的抑制机理  41
  3.7 精清成分对酶的活力调控  41-51
    3.7.1 几种无机离子对酶活力的影响  41-44
    3.7.2 必需氨基酸对酶活力的影响  44-47
    3.7.3 其它成分对酶活力的影响  47-51
  3.8 微量元素对酶的活力调控  51-61
    3.8.1 低浓度下微量元素对酶活力的影响  51-52
    3.8.2 Fe~(2+)对酶活力的抑制作用  52-53
    3.8.3 Zn~(2+)对酶活力的抑制作用  53-54
    3.8.4 Cu~(2+)对酶活力的抑制作用  54-55
    3.8.5 Mn~(2+)对酶活力的抑制作用  55-56
    3.8.6 Cr~(3+)对酶活力的抑制作用  56-57
    3.8.7 Na_2SeO_3对酶活力的抑制作用  57-59
    3.8.8 脱金属离子螯合剂（EDTA 2Na）对酶活性的影响  59
    3.8.9 Cu~(2+)和 Zn~(2+)对酶热稳定性的影响  59-61
4 讨论  61-70
  4.1 酶的分离纯化与酶学性质  61-63
  4.2 酶活性中心的功能基团  63-64
  4.3 酶的催化机理判断  64-65
  4.4 精清成分对酶活力的影响  65-67
  4.5 微量元素对酶活力的影响  67-70
结论  70-71
参考文献  71-78
已发表论文  78-79
致谢  79

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