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二穗短柄草BdHTA1的基因克隆和功能分析

作　者: 张康
导　师: 杨志民; 高彩霞
学　校: 南京农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 二穗短柄草 BdHTA1 Bradilg25390 基因克隆表达模式功能分析
分类号: S688.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本论文以二穗短柄草(Brachypodium distachyon)二倍体自交系BD21为试验材料。完成了二穗短柄草H2A基因BdHTA1的生物信息学分析工作。并对这个基因家族中的13个成员进行氨基酸序列比对和系统发生分析。选取其中最有可能提高农杆菌转化效率的AtHTA1同源基因Bradilg25390,进行基因克隆和功能分析。旨在揭示BdHTAs对提高遗传转化效率的应用可行性,将来运用在麦类作物的农杆菌转化上。主要研究结果如下：1.BdHTAs基因的克隆、序列对比和系统进化分析二穗短柄草H2A基因BdHTA1的生物信息学分析表明这个基因家族共有13个成员。氨基酸的序列进行比对和系统发生的分析表明：Bradi2g37330、Bradi2g23090、 Bradilg66360.1和Bradilg66360.2. Bradi4g28560、Bradilg66370以及Bradi4g06010的C-末端有—SPKK基序,可能是受细胞周期调控的H2A成员,可以聚为一类；Bradilg10390和Bradi4g06010的C-末端有一SQEF基序,可能是H2AX成员,归为第二类Bradilg25390、Bradi25400与AtHTA1属于第三类；剩下的Bradilg14960、Bradilg09060和Bradi3g26880归为第四类。其中Bradilg25390与Bradilg25400是最有可能提高农杆菌转化效率的AtHTA1同源基因。选取Bradilg25390获取相应的基因全长cDNA.2. Bradilg25390和HTA1的过量表达载体构建、转基因材料的获得和rat5突变体的功能互补将克隆到的Bradilg25390基因和AtHTA1连接到过量表达载体pGA3426上转化二穗短柄草BD21的愈伤。T1代转基因植物已经进行了PCR鉴定,结果表明：Bradilg25390已插入并整合到二穗短柄草BD21的基因组中。将Bradilg25390与拟南芥的阳性对照AtHTA1一起,连接到2×35SCaMV启动子驱动的过量表达载体pBINPLUS上用于拟南芥农杆菌转化HTA1缺失突变体rat5的功能互补验证。在拟南芥rat5中,我们得到了Bradilg25390互补rat5突变体的转基因植株。3.二穗短柄草Bradilg25390的亚细胞定位、器官表达模式的分析亚细胞定位分析表明：与空对照35SCaMV:GFP在细胞核、细胞质和细胞膜等上成遍在性分布的情形相比,Bradilg25390很明显仅仅分布洋葱表皮的细胞核中,在其他部位并不表达。利用半定量RT-PCR,初步分析了Bradilg25390的器官表达特异性。结果表明：Bradilg25390在根、茎、荚中的表达活性高而在叶中的表达活性低。4. Bradilg25390对提高遗传转化效率的应用可行性研究为了研究Bradilg25390对提高遗传转化效率的应用可行性,我们构建了Bradilg25390、AtHTA1和GUS能同时过量表达的双阅读框载体,并将这些载体在二穗短柄草BD018、BD21、小麦陇春23中进行农杆菌遗传转化。初步统计的结果表明：Bradilg25390、AtHTA1在过量表达的情况下,确实有提高GUS表达的作用,并且Bradilg25390在帮助提高外源报告基因GUS的表达上有着显著的效果。

全文目录

目录  4-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
前言  10-11
1 文献综述  11-25
  1.1 新型禾本科模式植物——二穗短柄草(Brachypodium distachyon)  11-13
    1.1.1 模式植物的概念及特点  11
    1.1.2 禾本科模式植物——二穗短柄草  11-13
  1.2 农杆菌介导的遗传转化方法的研究进展  13-19
    1.2.1 农杆菌的分类及根癌农杆菌的特点  14
    1.2.2 根癌农杆菌转化的步骤  14-17
    1.2.3 T-DNA的加工及其T-复合体的跨膜转移  17-19
    1.2.4 T-DNA的整合及在植物中的表达  19
  1.3 对于单子叶植物农杆菌介导的遗传转化方法的改良  19-20
    1.3.1 抗坏死物质的加入  19
    1.3.2 高渗处理  19
    1.3.3 干燥处理以及硝酸银的加入  19-20
    1.3.4 侵染液和共培养基的组成  20
  1.4 组蛋白H2A基因(HTA)的研究  20-23
    1.4.1 组蛋白H2A的结构和功能  20-21
    1.4.2 组蛋白H2A基因(HTA)的研究进展  21-23
  1.5 本学位论文的选题  23-25
2 材料与方法  25-45
  2.1 基因克隆  25-32
    2.1.1 二穗短柄草BD21无菌苗的培育  25
    2.1.2 RNA提取  25-26
    2.1.3 引物的设计  26
    2.1.4 RT-PCR  26-27
    2.1.5 PCR产物的克隆  27-30
    2.1.6 DNA测序  30
    2.1.7 序列同源性分析和进化树的绘制  30
    2.1.8 Bradilg25390和AtHTA1的过量表达载体构建  30-31
    2.1.9 拟南芥AtHTA1缺失突变体rat5的功能互补表达载体构建  31
    2.1.10 Bradilg25390、AtHTA1和GUS同时过量表达的双阅读框载体构建  31-32
  2.2 基因空间表达模式分析  32-36
    2.2.1 Bradilg25390在洋葱表皮细胞的亚细胞定位研究  32
    2.2.2 基因表达的半定量RT-PCR分析  32-34
    2.2.3 器官表达特异性的研究  34
    2.2.4 利用Promoter::GUS转基因植物分析基因的in situ表达模式  34-36
  2.3 农杆菌的转化  36-37
    2.3.1 菌株  36
    2.3.2 农杆菌感受态的制备  36-37
    2.3.3 农杆菌的转化  37
  2.4 农杆菌介导的二穗短柄草的转化  37-41
    2.4.1 材料和方法  37-38
    2.4.2 遗传转化流程概述  38-40
    2.4.3 转基因植株的鉴定  40-41
  2.5 农杆菌介导的拟南芥转化  41-42
    2.5.1 植物材料及培养基  41
    2.5.2 植物材料的常规种植  41
    2.5.3 转化方法  41-42
    2.5.4 转基因植株的鉴定  42
  2.6 农杆菌介学的小麦的遗传转化  42-45
    2.6.1 材料和方法  42-43
    2.6.2 遗传转化流程概述  43-44
    2.6.3 转基因植株的鉴定  44-45
3 结果和分析  45-55
  3.1 引言  45
  3.2 BdHTAs基因的克隆、序列对比和系统进化分析  45-48
  3.3 Bradilg25390和AtHTA1的过量表达载体构建、转基因材料的获得和rat5突变体的功能互补  48-49
  3.4 二穗短柄草Bradilg25390的亚细胞定位、器官表达模式的分析  49-51
  3.5 Bradilg25390对提高遗传转化效率的应用可行性研究  51-55
4 讨论  55-57
  4.1 对于BdHTAs基因克隆、氨基酸序列比对和系统发生分析  55
  4.2 对于二穗短柄草Bradilg25390的亚细胞定位和器官表达模式分析  55
  4.3 对于利用Bradilg25390促进农杆菌遗传转化特性  55-56
  4.4 对于其它一些跟农杆菌遗传转化有关的基因  56
  4.5 总结  56-57
5 全文结论  57-59
参考文献  59-67
附图  67-71
致谢  71

二穗短柄草BdHTA1的基因克隆和功能分析

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