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致绵羊脑炎李氏杆菌在模型小鼠体内的动态分布及actA、inlB毒力基因的序列测定

作　者: 高磊
导　师: 剡根强；蒋建军
学　校: 石河子大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 致羔羊脑炎李氏杆菌小鼠模型分布毒力基因克隆
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

李氏杆菌病(Listeriosis)是一种重要的人畜共患病原菌,主要由单核细胞增多性李氏杆菌引起。本菌对人、家畜、家禽、野生动物均有侵袭力,可引起人及各种动物的脑炎、败血症及流产,在公共卫生方面有其特殊的重要性。近年来,有关LM对人及动物的致病机理成为研究的热点.本研究通过对LM标-2株和绵羊-90株LD50的测定,建立人工感染小鼠模型,采取感染后不同时间小鼠的脏器,采用PCR方法、分离培养及病理组织学方法对感染模型小鼠体内的李氏杆菌动态分布及各器官的病理组织学变化进行初步研究以并对致绵羊脑炎李氏杆菌分离株的actA和inlB毒力基因进行了克隆及序列分析,研究结果如下：1、利用Karber法计算得知：LM标-2株的LD50为：4.180×108CFU/ml; S-90的LD50为：2.85×108CFU/ml。表明S90株的毒力强于标-2株。2、S-90株感染后2h,脾、肝、肾、心血组织中均可检测到李氏杆菌DNA,同时从上述脏器也可分离到李氏杆菌；感染后6h大脑中可检测到李氏杆菌DNA,并在感染后72h可分离到该细菌；感染4-6h后脾、肾、心血、肝脑即开始出现病理变化和组织学变化。标-2株则是在感染后2h,均可以从脾、肝、肾、心血、大脑中检测到李氏杆菌,同时从脾、肝、肾、心血中可分离到该菌,感染后8h大脑中可检测到李氏杆菌DNA,而大脑需要在72h后分离到该菌。感染6h后脾、’肾、心血、肝脑即开始出现病理变化和组织学变化。说明S-90株更容易侵袭各个脏器和突破血脑屏障。3、采用PCR分别扩增致绵羊脑炎单核细胞增多性李氏杆菌和食源型单核细胞增多性李氏杆菌actA结构基因和inlB结构基因的部分片段,结果含有actA基因为标-2、S-90；含有inlB基因为标-2、S-90;并将含有actA结构基因和inlB结构基因的PCR产物克隆至PMD19-T载体上,通过PCR和双酶切鉴定后进行序列测定,测序后的序列与GenBank上相应的序列作比较,结果显示,含有actA结构基因的标-2株、S-90株与原序列的同源性为99.10%、92.71%,含有inlB结构基因的标-2、S-90与对应的原序列的同源性为：99.68%、92.54%。表明不同来源的李氏杆菌在多态性方面存在一定的联系。该研究结果为进一步研究人及家畜的李氏杆菌致病机理提供了有价值的试验数据,为今后研究LM致病的分子机制奠定了基础。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-7
目录  7-10
符号说明  10-11
前言  11-12
第一部分文献综述李氏杆菌的研究进展  12-22
  1、生物学特性  12-13
  2、传播途径  13-14
  3、致病机理  14
  4、动物模型  14-15
    小鼠模型  14
    其他动物模型  14-15
  5、LM的毒力因子  15-17
    LLO蛋白  15-16
    actA蛋白  16-17
    inlB蛋白  17
    其他毒力因子  17
  6、LM检测技术研究进展  17-22
    传统分离鉴定方法  17-18
    免疫学检测方法  18
    核酸检测方法  18
    PCR检测方法  18-19
    基质辅助激光解析电离方法  19-20
    Lm分子生物学分型的研究与应用  20
    核糖体分型  20
    随机引物DNA多态性分型  20
    脉冲场凝胶电泳分型  20-22
第二部分实验研究  22-45
  试验一致绵羊脑炎单核细胞增多性李氏杆菌的LD_(50)的测定  22-26
    1 材料  22
      1.1 菌株  22
      1.2 主要试剂及仪器  22
      1.3 实验动物  22
    2 实验方法  22-23
      2.1 细菌的培养  22
      2.2 细菌的浓缩与稀释  22
      2.3 细菌计数  22-23
      2.5 半数致死量LD_(50)的测定  23
      2.6 数据统计  23
    3 结果与分析  23-24
      3.1 细菌计数结果  23
      3.2 半数致死量LD_(50)的测定  23-24
      3.3 实验动物死亡后病理剖解的肉眼观察  24
      3.4 不同来源的LM的致病力比较  24
    4 讨论  24-26
  实验二致绵羊脑炎单核细胞增多性李氏杆菌在模型小鼠体内的动态分布及病理变化  26-35
    1 材料  26-27
      1.1 试验菌株  26
      1.2 试验动物  26
      1.3 培养基  26
      1.4 主要试剂  26-27
      1.5 主要试剂的配置  27
        (1) 伊红染液的配制  27
        (2) 苏木素染液的配制  27
        (3) 蛋白甘油的配制  27
        (4) 1%盐酸酒精  27
      1.6 主要仪器  27
    2 方法  27-29
      2.1 LM的培养  27
      2.2 LM在人工感染小鼠体内的动态分布测定  27-28
        2.2.1 细菌的分离鉴定  27
        2.2.2 PCR方法程序  27-28
      2.3 组织病理学观察  28-29
        2.3.1 取材和固定  28
        2.3.2 水洗  28
        2.3.3 脱水  28
        2.3.4 透明  28
        2.3.5 浸蜡  28
        2.3.6 包埋  28
        2.3.7 H-E染色  28-29
    3 结果  29-33
      3.1 不同源的LM在人工感染小鼠体内的分布规律  29-31
        3.1.1 细菌学检查  29
        3.1.2 细菌PCR检测结果  29-31
      3.2 病理变化  31-33
        3.2.1 病理解剖变化  31-32
        3.2.2 病理组织学变化  32-33
    4 讨论  33-35
      4.1 小鼠模型的建立  33
      4.2 关于LM在小鼠体内的动态分布规律的研究  33-34
      4.3 关于LM感染小鼠后引起各组织的病理性变化  34-35
  实验三致绵羊脑炎单核细胞增多性李氏杆菌actA和inlB基因的克隆与序列分析  35-45
    1、材料  35
      1.1 菌种  35
      1.2 主要试剂  35
      1.3 主要仪器  35
    2、方法  35-38
      2.1 不同源LM基因组DNA的提取  35-36
      2.2 引物设计及PCR反应体系  36
        2.2.1 actA引物设计  36
        2.2.2 actA基因的PCR反应体系(50uL)  36
        2.2.3 inlB引物设计  36
        2.2.4 inlB基因的PCR反应体系(50uL)  36
      2.3 PCR产物提纯  36-37
      2.4 DNA的连接  37
      2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备  37
      2.6 重组DNA的转化  37
      2.7 克隆结果的鉴定  37
        2.7.1 白斑菌落PCR鉴定  37
        2.7.2 质粒的小剂量制备  37
        2.7.3 重组质粒的酶切鉴定  37
      2.8 重组目的基因的核营酸序列测定  37-38
    3、结果  38-45
      3.1 actA蛋白基因PCR扩增结果  38
      3.2 inlB蛋白基因PCR扩增结果  38-39
      3.3 actA基因PCR产物的克隆  39
      3.4 inlB基因PCR产物的克隆  39
      3.5 质粒的酶切鉴定  39-41
      3.6 actA和inlB基因的系统进化树及其分析  41-43
      3.7 讨论  43-45
结论  45
主要创新点  45-46
参考文献  46-52
致谢  52-53
作者简介  53
在学期间发表的文章  53-54
附图5  54-55
附图6  55-56
师评阅表  56

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