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水稻抗稻瘟病菌质膜蛋白的蛋白质组学分析

作 者: 李猛
导 师: 张红生
学 校: 南京农业大学
专 业: 作物遗传育种
关键词: 水稻 稻瘟病 质膜蛋白 蛋白质组 功能分析
分类号: S511
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe oryzae (Hebert) Barr[无性世代为Pyricularia grisea (Cooke) Sacc]引起的最严重的水稻三大病害之一,严重影响水稻的产量和品质。稻瘟病菌在侵入寄主细胞时,初始侵染菌丝和扩展菌丝在侵染过程中都不直接与侵染细胞的胞质接触,而是通过一层来源于侵入细胞的细胞质膜膜状结构(EIHM)与侵染细胞的胞质隔离。植物质膜蛋白是一类具有独特结构的蛋白质,镶嵌于膜脂的特性使这一类蛋白处于细胞与外界的交界部位,介导细胞与外界之间的信号传导,并执行很多基本的和重要的细胞生物学功能,在植物抵御病原物侵染防卫反应信号传导途径中也起着重要的作用。为了研究水稻叶片质膜蛋白在水稻抗稻瘟病过程中的作用,本文采用改进的质膜蛋白提取、纯化和双向电泳方法,分析了太湖流域抗稻瘟病品种黑壳子粳在稻瘟病菌菌株北1接种前和接种后24h的叶片质膜蛋白表达变化,发现有28个蛋白的表达在接种前后存在差异。其中21个为上调表达,7个为下调表达。通过对这28个蛋白点进行质谱鉴定和二级串联质谱MS/MS鉴定,结果表明28个诱导表达蛋白可分为五类:(1)参与植物生长代谢相关的酶类:二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO)、Y衰老相关蛋白、ATP酶;(2)参与植物信号转导的相关蛋白:磷脂酶C(PLC)、膜连蛋白(Annexin)和谷胱甘肽-s-转移酶(GST);(3)与植物物质合成分解调节有关的蛋白:ACC氧化酶(ACO)、调控质膜多肽(DREPP)、ATP合成酶(ATP synthase)、磺基转移酶(SULT);(4)与抗氧化系统相关的蛋白:抗坏血酸过氧化物酶(APX)、酪氨酸激酶(PTKs);(5)功能未知的蛋白:14-3-3类似蛋白。针对质谱鉴定与前人已有的研究结果,我们选取了一个Remorin蛋白对其进行克隆和相关的功能验证,已有的研究表明Remorin蛋白是一个植物专一性蛋白,其广泛地参与拟南芥,烟草等植物的生物胁迫和非生物胁迫过程,在豆科和茄科植物中都参与植物的抗病过程,但是目前对于其具体的抗病机理还不清楚。我们通过对稻瘟病抗感水稻品种在接种稻瘟病不同时间段Remorin蛋白的表达分析发现:OsREM1.2蛋白在抗感品种的表达方式存在明显差异,在抗病品种的表达水平明显高于感病品种中的表达水平,说明OsREM1.2蛋白可能在水稻品种黑壳子粳的抗稻瘟病过程中发挥重要作用。

全文目录


摘要  7-8ABSTRACT  8-10第一章 文献综述  10-18  1 水稻蛋白质组学的研究进展  10-14    1.1 蛋白质组学的概念  10    1.2 蛋白质组学技术的发展  10-11      1.2.1 蛋白质分离技术  11      1.2.2 蛋白质的鉴定技术  11      1.2.3 蛋白质组学的数据库建设  11    1.3 水稻蛋白质组学研究  11-14      1.3.1 水稻发育过程中的蛋白质组学研究  12      1.3.2 水稻胁迫过程中的蛋白质组学研究  12-13      1.3.3 水稻抗稻瘟病蛋白质组学研究进展  13-14      1.3.4 水稻亚细胞水平的蛋白质组学研究  14  2. 稻瘟病抗性及相关机理的研究  14-16    2.1 保卫假说  15    2.2 基因对基因假说  15    2.3 防卫假说  15-16  3. 抗病相关蛋白的研究  16-18    3.1 参与能量代谢  16    3.2 参与物质合成与分解  16-17    3.3 参与抗氧化系统  17    3.4 参与信号转导  17-18第二章 水稻抗稻瘟病菌质膜蛋白的蛋白质组学分析  18-38  1 材料与方法  18-23    1.1 植物材料与育苗  18    1.2 供试病菌及培养  18-19    1.3 接种  19    1.4 叶片的荧光染色处理  19    1.5 水稻叶片的酸性品红染色  19-20    1.6 水稻叶片质膜蛋白的提取和纯化  20-21    1.7 质膜蛋白的Western Blot检测  21-22      1.7.1 SDS-PAGE电泳  21      1.7.2 转膜和洗膜  21-22    1.8 质膜蛋白的双向电泳与质谱鉴定  22-23  2. 结果与分析  23-33    2.1 抗感品种的抗性差异鉴定  23-27    2.2 质膜蛋白的Western Blot检测  27-28    2.3 质膜蛋白双向电泳与蛋白组比较  28-31    2.4 差异表达蛋白的质谱鉴定  31-33  3. 讨论  33-38第三章 差异表达蛋白OsREM1.2的克隆与功能分析  38-50  1 材料与方法  38-44    1.1 植物材料的处理  38    1.2 质粒与菌株  38-39    1.3 相关试剂  39    1.4 常用培养基  39    1.5 引物  39    1.6 水稻叶片总RNA提取  39-40    1.7 总RNA质量检测和浓度测定  40-41    1.8 cDNA第一链的合成  41    1.9 重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞  41    1.10 基因枪转化  41-42    1.11 洋葱表皮细胞的侵染与转化  42    1.12 大肠杆菌质粒DNA的提取与纯化  42-43    1.13 Remorin蛋白基因OsREM1.2的原核表达  43-44  2 结果与分析  44-48    2.1 OsREM1.2基因的克隆  44-46    2.2 OsREM1.2基因表达  46    2.3 OsREM1.2的亚细胞定位  46-47    2.4 OsREM1.2的原核表达  47-48  3 讨论  48-50全文结论  50-52参考文献  52-58致谢  58

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