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油茶PAL基因的全长克隆及其在原核和真核生物中的表达

作　者: 田晓明
导　师: 谭晓风
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 生物化学与分子生物
关键词: 油茶苯丙氨酸解氨酶基因基因克隆基因重组载体构建
分类号: S794.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

油茶(Camellia oleifera)是我国重要的木本食用油料树种,与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本食用油料树种。茶油中油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸的含量在90%以上,是一种优质食用油。但是由于病虫害时常发生,严重影响油茶林的发展和经济效益的发挥。目前,研究较多的与植物抗病性相关的酶是苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL),它是苯丙烷类代谢途径的第一个关键酶、限速酶。苯丙烷类代谢化合物对植物生长、抗病、抗逆及构成植物支撑系统方面具有重要作用。因此,对油茶PAL的基因操作具有重要的实际意义。本论文主要在油茶PAL的克隆、鉴定以及表达载体构建方面开展了一些研究工作,主要研究结果如下：1、油茶PAL基因的全长cDNA克隆及生物信息学分析。从本实验室油茶cDNA文库中鉴定出一条PAL基因的全长cDNA,长度为2118bp,经与核酸数据库进行比对分析,确定为PAL基因,该基因编码705个氨基酸。应用一系列生物信息学分析方法对其等电点、分子量、跨膜结构、疏水性、二级结构进行预测分析,结果显示：PAL蛋白质的分子量为77.077KDa,等电点为6.115。PAL整个蛋白的疏水指数从-2.656到3.244,其中除在110位、340位以及480位氨基酸表现出亲水性,整条多肽链表现出疏水性。PAL蛋白有两个比较明显的跨膜区。PAL蛋白二级结构中α螺旋结构为52.55%,β折叠为6.23%,无规则卷曲及其他结构达到了41.22%。纵观PAL蛋白质的整体结构,α螺旋是油茶PAL的主要结构元件,而不规则卷曲则散布于整个蛋白质中。2、油茶PAL基因的全长基因组序列克隆。根据油茶PAL全长cDNA序列设计引物,以油茶总DNA为模板,通过PCR反应,克隆油茶PAL基因组序列,结果分析显示：该基因有一个内含子,长度为768bp,位于起始密码子下游372bp处,而且内含子两端具有保守序列GT/AG。3、油茶PAL基因的原核表达。将编码油茶PAL的片段定向克隆到pET-28a载体上,构建的原核表达载体命名为pET-PAL。采用24℃低温诱导重组菌20h,提取细菌粗酶液,检测酶学活性表明：重组蛋白的最适温度为70℃,最适pH为8.7。在最适条件下,测得PAL的酶活力为2.583×10-2U,从而计算出苯丙氨酸解氨酶PAL的比活力为36.38μmol/min·g pro。与其他文献报道中相比,油茶重组PAL比活力低于大豆、欧芹重组蛋白活性,高于红酵母重组PAL蛋白的活性,但总体看来,油茶重组PAL活性不是很高,可能不同物种间基因存在一定的差异。4、油茶PAL基因的真核表达。对PALcDNA片段和pBI121载体分别进行XbaⅠ和BamH I的双酶切,回收连接,构建植物表达载体pBI-PAL,对野生型拟南芥进行遗传转化,得到T0代种子,经含抗性培养基筛选,得到若干阳性植株,对其中7株进行DNA微量提取,并采用PCR技术做了验证,初步证明已获得5株含PAL的转基因拟南芥。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略词  10-11
1 绪论  11-21
  1.1 油茶概述  11
  1.2 油茶的分子生物学研究  11-14
    1.2.1 油茶的分子标记研究  11-12
    1.2.2 油茶的cDNA文库和EST文库的构建  12-13
    1.2.3 油茶转基因育种  13-14
  1.3 苯丙氨酸解氨酶研究现状  14-18
    1.3.1 苯丙氨酸解氨酶的分布  14-15
    1.3.2 苯丙氨酸解氨酶的生物化学性质  15
    1.3.3 植物苯丙氨酸解氨酶基因研究现状  15-18
  1.4 油茶病虫害防治现状  18
  1.5 本研究的意义、主要内容和技术路线  18-21
2 油茶苯丙氨酸解氨酶基因克隆与序列分析  21-39
  2.1 材料与方法  21-26
    2.1.1 材料  21-22
    2.1.2 方法  22-26
  2.2 结果与分析  26-36
    2.2.1 油茶RAL基因全长cDNA克隆  26-29
    2.2.2 油茶PAL基因的全长基因组序列克隆  29
    2.2.3 生物信息学分析  29-36
  2.3 讨论  36-39
3 油茶PAL基因在大肠杆菌中的表达  39-47
  3.1 材料与方法  39-43
    3.1.1 材料  39-40
    3.1.2 实验方法  40-43
  3.2 结果与分析  43-45
    3.2.1 油茶PAL基因原核表达载体构建  43
    3.2.2 油茶PAL表达产物的SDS-PAGE分析  43-44
    3.2.3 油茶PAL酶学性质分析  44-45
  3.3 讨论  45-47
4 油茶PAL基因在真核生物中的表达  47-57
  4.1 材料与方法  47-52
    4.1.1 材料  47-48
    4.1.2 实验方法  48-52
  4.2 结果与分析  52-54
    4.2.1 植物表达载体构建  52
    4.2.2 农杆菌阳性克隆鉴定  52-53
    4.2.3 转基因拟南芥的PCR鉴定  53-54
  4.3 讨论  54-57
5 结论与创新点  57-58
  5.1 结论  57
  5.2 创新点  57-58
参考文献  58-66
附录A:基因登陆图  66-67
附录B:主要试剂的配制  67-69
附录C:主要仪器设备  69
附录D:硕士期间的主要学术成果  69-70
致谢  70

油茶PAL基因的全长克隆及其在原核和真核生物中的表达

内容摘要

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