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蜡梅病程相关蛋白基因CpPR-4的克隆及功能初步分析

作　者: 秦朝
导　师: 李名扬
学　校: 西南大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 病程相关蛋白4基因克隆植物表达载体原核表达载体功能分析
分类号: S436.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

病程相关蛋白(pathogenesis-related protein,PRs)是植物在受到病原体入侵或受到非生物胁迫时产生和积累的一类蛋白,它是植物自我防御机制中的可诱导组分。研究表明植物体内病程相关蛋白的显著提高,影响着植物防卫反应,可以提高植物体的相关抗性。因此利用和开发病程相关蛋白,可成为一条提高植物自身抗性的有效途径。目前发现的病程相关蛋白家族约有17个,分别是PR-1到PR-17。本文在已有的基础上,从蜡梅cDNA文库中克隆出一个蜡梅病程相关蛋白4基因即CpPR-4基因,首先对基因的编码蛋白进行生物信息学分析以及功能的初步预测,随后构建CpPR-4基因的植物表达载体及原核表达载体,并对其功能进一步的验证,主要研究结果如下：获得了蜡梅病程相关蛋白4基因的全长编码区,并运用生物信息学方法对蜡梅CpPR-4基因编码蛋白的性质与结构特点进行分析,结果表明其编码142个氨基酸,理论分子量约为15KD,预测等电点为5.57,无内含子的存在,具2个磷酸化位点,存在信号肽,CpPR-4蛋白二级结构由α螺旋(α-helix,26.76%),延伸链(extended strand,26.06%),随机卷曲(random coil,33.10%)和少量β转角(βturn,14.08%)构成,在NCBI上对其保守结构域分析发现CpPR-4基因编码的蛋白具有DPBB1超家族的特征。构建了蜡梅CpPR-4基因的植物表达载体pCAMBIA2301g/CpPR-4,通过农杆菌介导将该植物表达载体转入到野生型烟草植株中,并获得转基因植株14株。通过烟草花叶病毒侵染试验和蛙眼病菌侵染试验表明,转基因烟草对烟草花叶病毒无明显抗性,而对蛙眼病病菌有一定抗性；低温胁迫试验发现,相较野生型烟草,CpPR-4基因的表达提高了转基因烟草植株对低温不利环境的抗性。构建了目的基因的原核表达载体pET-32a/CpPR-4,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),经条件优化诱导获得大小约36KD的目的融合蛋白,对融合蛋白进行可溶性分析发现其以包涵体形式存在。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第1章文献综述  11-21
  1.1 蜡梅的研究与利用  11
  1.2 病程相关蛋白的发现  11
  1.3 病程相关蛋白(PRs)的分类及特征  11-14
  1.4 病程相关蛋白的生物化学和分子结构特性  14-15
  1.5 病程相关蛋白的分布及诱导  15-16
    1.5.1 病程相关蛋白的分布  15
    1.5.2 病程相关蛋白的诱导及诱导因子  15-16
  1.6 病程相关蛋白的抗病机制  16-17
  1.7 病程相关蛋白的功能  17-19
    1.7.1 抑制细菌、真菌的生长或病毒的复制  17-18
    1.7.2 固化细胞壁  18
    1.7.3 诱导植物抗毒素和细胞内毒素  18
    1.7.4 调控植物的生长发育  18-19
  1.8 病程相关蛋白PR-4家族  19-21
    1.8.1 PR-4家族的发现  19
    1.8.2 PR-4家族的特性  19
    1.8.3 PR-4家族的功能  19-21
第2章引言  21-23
  2.1 研究背景  21
  2.2 研究意义  21
  2.3 技术路线  21-23
第3章蜡梅病程相关蛋白基因CpPR-4的克隆与序列分析  23-35
  3.1 实验材料  23-24
    3.1.1 植物材料,菌株及载体  23
    3.1.2 主要仪器设备  23
    3.1.3 主要化学试剂  23
    3.1.4 自配的试剂及常用配方  23-24
  3.2 实验方法  24-27
    3.2.1 EST序列特征分析  24
    3.2.2 引物设计  24
    3.2.3 蜡梅总DNA的提取  24-25
    3.2.4 PCR扩增  25
    3.2.5 BioSpin Gel Extraction kit回收目的DNA片段  25
    3.2.6 回收纯化产物与pMD19-T载体连接  25-26
    3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备  26
    3.2.8 将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中  26
    3.2.9 转化子的鉴定  26
    3.2.10 测序分析  26-27
  3.3 生物信息学分析  27
  3.4 结果与分析  27-33
    3.4.1 蜡梅CpPR-4克隆子的获得  27-28
    3.4.2 蜡梅CpPR-4基因cDNA的序列特征  28
    3.4.3 CpPR-4基因编码蛋白的同源比对  28-30
    3.4.4 CpPR-4基因编码蛋白的信号肽分析  30
    3.4.5 CpPR-4基因编码蛋白的疏水性区域分析  30-31
    3.4.6 CpPR-4基因编码蛋白的二级结构预测  31
    3.4.7 CpPR-4基因编码蛋白的三级结构预测  31-32
    3.4.8 CpPR-4基因编码蛋白的磷酸化位点分析  32
    3.4.9 CpPR-4基因编码蛋白的卷曲螺旋分析  32-33
  3.5 小结  33-35
第4章植物表达载体的构建与转化烟草研究  35-49
  4.1 实验材料  35-36
    4.1.1 植物材料  35
    4.1.2 菌株与载体  35
    4.1.3 主要试剂  35
    4.1.4 自配的试剂  35-36
    4.1.5 常用培养基配方  36
  4.2 实验方法  36-41
    4.2.1 构建植物表达载体pCAMBIA2301g/CpPR-4  36-39
    4.2.2 CpPR-4基因导入烟草及转化植株的获得  39
    4.2.3 转基因植株的检测  39-40
    4.2.4 转基因烟草的抗病性鉴定试验  40
    4.2.5 转基因烟草的低温胁迫性实验  40-41
  4.3 结果与分析  41-46
    4.3.1 植物表达载体的构建  41-42
    4.3.2 CpPR-4基因转化烟草以及转化植株的获得  42-43
    4.3.3 转基因植株的检测  43-44
    4.3.4 蜡梅CpPR-4基因转基因烟草的抗病性鉴定试验  44-45
    4.3.5 蜡梅CpPR-4基因转基因烟草的低温胁迫性实验  45-46
  4.4 小结  46-49
第5章原核表达载体的构建与目的蛋白的融合表达  49-63
  5.1 实验材料  49-52
    5.1.1 实验菌株  49
    5.1.2 主要试剂  49
    5.1.3 主要设备  49-50
    5.1.4 自配的主要试剂  50-52
  5.2 实验方法  52-56
    5.2.1 蜡梅CpPR-4基因原核表达载体的构建  52-53
    5.2.2 目的蛋白的诱导表达  53-54
    5.2.3 SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达  54-55
    5.2.4 表达体系的优化  55-56
  5.3 结果与分析  56-61
    5.3.1 蜡梅CpPR-4基因原核表达载体的构建  56-57
    5.3.2 pET-32a/CpPR-4在BL21(DE3)中的融合表达  57-59
    5.3.3 表达体系的优化  59-61
  5.4 小结  61-63
第6章讨论  63-67
  6.1 蜡梅CpPR-4基因的克隆及编码蛋白的特性  63
  6.2 植物表达载体的构建及烟草的遗传转化体系  63-64
  6.3 转基因烟草的抗病性分析  64-65
  6.4 转基因烟草的抗寒性分析  65
  6.5 原核表达载体的构建及重组蛋白表达体系的优化  65-67
第7章总结  67-69
  7.1 结论  67
  7.2 后续工作  67-69
参考文献  69-77
缩略词表  77-79
致谢  79-80
发表论文与参加的研究课题  80

蜡梅病程相关蛋白基因CpPR-4的克隆及功能初步分析

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