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利用Shuffling技术改良纤维素葡聚糖内切酶（EGI）酶活的研究

作　者: 姜大磊
导　师: 王丕武
学　校: 吉林农业大学
专　业: 作物生物技术
关键词: shuffling改组技术 IPTG 突变体库原核表达载体
分类号: S216.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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引　用: 1次
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内容摘要

纤维素是自然界广泛存在的一种大分子,在现实生活中也被广泛应用。但是由于技术和利用效率限制了纤维素的价值和效益。在过去的几十年中,许多学者通过传统方法,原生质体融合,基因工程等技术做了大量的研究,试图转化地球上大量的、可再生的纤维素资源,以代替日益枯竭的对环境造成破坏的石化能源。然而,纤维素生产的高成本严重制约了纤维素生物转化产业的发展,解决这一问题的关键就是寻找新的高产菌株或者通过创新的生物技术改造纤维素酶的基因,以此来提高酶的生物转化效率。本研究期望通过提高纤维素酶的活性从一定程度上缓解这些矛盾。近年来发展起来的体外定向进化技术,可以在未知目标蛋白三维结构信息和作用机制的情况下,通过编码基因的随机突变,重组和定向筛选,获得具有改进功能的蛋白质,该技术是可用于有任何有合适筛选或者选择方法的蛋白质的改造。本研究以绿色木霉中的纤维素酶为母本,分别筛选出了4株高产菌株。通过鉴定发现,大部分属于耐热性和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型菌株,从中克隆了纤维素内切葡聚糖酶(EGI)的基因,进行测序比对,发现序列大小稳定,具有一定的多样性,比对结果为51.96%,可以发现体外定向进化比随机进化具有较高的筛选率,同时也可以推断EGI可能具有更高的进化空间。方法：1.提取绿色木霉DNA基因组,通过PCR克隆和大肠杆菌感受态转化,重组子鉴定得到野生型EGI基因序列,对此序列引物设计和测序,得到相似度99.68%的准确EGI序列。2.利用shuffling改组技术,经过DNase I降解、PrimerleSs PCR、 Touchdown PCR对纤维素内切酶基因进行了突变和改组,然后将改组的纤维素内切酶基因插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建了重组子突变体库。通过羧甲基纤维素钠培养基进行筛选,得到活性比较高的的纤维素葡聚糖酶菌株。3.对这些菌株通过3,5-二硝基水杨酸法(DNS)进行酶活检测,根据葡萄糖浓度标准曲线图以及酶促反应后反应液550nm的吸光值计算酶的活力。4.通过温度梯度20、30、40、50、60、70℃条件下和IPTG浓度梯度0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.Ommol/L的设置,对其诱导表达条件进行优化。结果：1.培养绿色木霉,并对其进行了基因组的提取和鉴定。以此为模板,通过克隆测序得到纤维素葡聚糖内切酶。2.采用DNA shuffl ing的体外定向进化技术,本研究建立了来源于BL21(DE3)的EGI突变体库。通过原核表达载体pET-28a(+),利用刚果红染色法对突变体库的1×103株克隆菌株进行筛选,得到了4株高活性突变体。其中S1、 S2、 S3、 S4的酶活力分别提高到野生型酶活力的5.75、4.78、3.19和3.61倍。并对酶学性质进行了初步分析,酶活最高水平出现在诱导后6.5小时左右,56.52U/mL。3.对S1代菌株进行诱导条件的优化。当IPTG浓度为0.Olmmol/L的时,产酶能力最好。随着温度的升高,酶的反应速度和酶失活的速度都随之增加,在两种因素的作用下,当温度到50℃的时,产酶能力最好。4.生物信息学检测和酶学性质研究得到重组蛋白没有跨膜区,相对分子质量54517.4,等电点9.51,分子式C2419H3753N715O675S27,与原来基因比对相似度为51.96%,重组蛋白与原始蛋白相似度为55%。本研究为采用DNA shuffling改组的方法改造纤维素内切葡聚糖酶提供了有价值的技术支持,并为其他蛋白质的定向进化提供了可借鉴的经验。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
第一章绪论  9-26
  1.1 纤维素生物技术的发展现状与前景  9-11
    1.1.1 酸水解工艺  10
    1.1.2 酶水解工艺  10-11
  1.2 降解天然纤维素原料的动物  11-12
  1.3 产纤维素酶的微生物  12-14
    1.3.1 细菌域微生物  12-13
    1.3.2 古菌域微生物  13
    1.3.3 真核域微生物  13-14
  1.4 纤维素酶简介  14-16
  1.5 高产纤维素酶生产菌种的选育  16-18
  1.6 纤维素酶的应用  18-20
    1.6.1 纤维素酶与生态农业  18-19
    1.6.2 纤维素酶与清洁能源  19
    1.6.3 纤维素酶与纺织工业  19
    1.6.4 纤维素酶与食品工业  19-20
  1.7 酶的定向进化  20-23
    1.7.1 定向进化的起源和原理  20-21
    1.7.2 酶定向进化的主要方法  21-22
    1.7.3 纤维素酶定向进化的研究进展  22-23
    1.7.4 内切葡聚糖酶的定向进化  23
  1.8 研究内容和意义  23-24
  1.9 目的特色与创新  24-26
第二章纤维素葡聚糖内切酶(EGI)基因克隆和序列分析  26-41
  2.1 实验材料  26-28
    2.1.1 菌株及质粒  26
    2.1.2 培养基  26
    2.1.3 试剂  26-27
    2.1.4 仪器设备  27-28
  2.2 实验方法  28-34
    2.2.1 绿色木霉基因组DNA的提取  28-29
    2.2.2 特异性引物的设计  29
    2.2.3 纤维素葡聚糖内切酶(EGI)基因的克隆  29-31
    2.2.4 重组克隆载体的构建  31-32
    2.2.5 重组克隆载体的鉴定  32-34
  2.3 结果与讨论  34-41
    2.3.1 绿色木霉基因组DNA的提取  34-35
    2.3.2 引物设计  35-36
    2.3.4 重组克隆载体的构建  36-37
    2.3.5 测序结果及序列分析  37-41
第三章利用Shuffling技术改良纤维素葡聚糖内切酶(EG Ⅰ)酶活  41-55
  3.1 材料与方法  41-42
    3.1.1 质粒与菌株  41-42
    3.1.2 酶与试剂  42
  3.2 方法  42-44
    3.2.1 ±50bp DNA消化片段的制备  42
    3.2.2 离子交换纸回收DNA片段  42
    3.2.3 DNA改组——有性PCR  42-43
    3.2.4 突变体库构建及其筛选  43
    3.2.5 酶活力表达测定  43-44
    3.2.6 IPTG诱导剂浓度的优化  44
    3.2.7 温度条件的优化  44
    3.2.8 重组基因的测序及比对  44
  3.3 生物信息学检测和酶学性质研究  44
  3.4 结果与分析  44-55
    3.4.1 DNase Ⅰ酶切条件确定  44-45
    3.4.2 Primerless PCR重聚和Touchdown PCR扩增目的片段  45-46
    3.4.3 突变体库构建检测及其菌株筛选  46-47
    3.4.4 酶活力的测定  47-48
    3.4.5 IPTG诱导剂浓度和温度条件的优化  48-50
    3.4.6 生物信息学检测和酶学性质研究  50-55
第四章讨论与结果  55-57
  4.1 讨论  55-56
  4.2 结果  56-57
参考文献  57-62
附录  62-67
  附录1 英文缩略词表  62-63
  附录2 培养基及常用试剂的配制  63-67
致谢  67-68
作者简介  68-69
附件  69

利用Shuffling技术改良纤维素葡聚糖内切酶（EGI）酶活的研究

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