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桃褐腐菌角质酶的克隆与表达

作　者: 麻莹
导　师: 田平芳
学　校: 北京化工大学
专　业: 粮食、油脂及植物蛋白工程
关键词: 角质酶桃褐腐菌肺炎克雷伯杆菌毕赤酵母基因克隆表达酶活
分类号: S436.621
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

角质酶是一种具有水解酯键能力的酶，属于α/β水解酶家族中的一种。可以催化水解各种长短链的甘油三酯等酯类。由于反应条件温和、催化效率高等特点，近些年来在纺织、食品等行业中应用非常广泛。桃褐腐菌(Monilinia fructicola)是一种可致桃树果实腐烂的真菌，对果实生产造成严重经济损失。其侵染桃果实的主要过程就是诱导自身表达角质酶，分解桃果实表皮中的角质类物质。现阶段对于基因工程生产角质酶的研究集中在腐皮镰胞菌(Fusarium solani)角质酶基因和嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)等菌种中，通过获取这两类菌体中的角质酶基因进行基因工程菌的构建。然而文献中对于桃褐腐菌角质酶基因的应用并不深入。原核基因工程表达系统具有发酵时间短、高效、构建过程简单等优点。本实验采用大肠杆菌(E.coli)BL21及肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)两种表达系统，分别使用pET-28a质粒及pET-PK质粒。在大肠杆菌的甘油代谢途径中，pET-28a可由IPTG诱导T7启动子大量胞内表达重组载体中的基因片段。在肺炎克雷伯菌的甘油代谢途径中，由于克雷伯菌自身的组成型启动子是PK启动子，在甘油存在的条件下即可表达。pET-PK质粒由pET-28a质粒改造而得，将原有的T7启动子换成PK启动子后，下游连接重组片段参与工程菌的组成型胞内表达。本实验通过获取桃褐腐菌角质酶基因cutl,分别连接至pET-28a与pET-PK质粒中。重组大肠杆菌pET-28A-cutl/BL21由化学法转化而得,重组克雷伯菌pET-PK-cutlk.p由电转化方法而得。通过对两株重组菌表达条件分析、表达生物量测定、表达单位蛋白量测定、表达单位酶活量测定等步骤,可确定重组大肠杆菌在诱导表达18小时后产生角质酶的酶活可达每100μL4U,重组克雷伯菌在表达21小时后酶活可达每100μL5U,然而重组克雷伯菌的单位蛋白量并没有显著提高,说明表达量尚有可上升的空间。此外,本实验成功构建了重组毕赤酵母pPICZaA-cutl/GS115重组菌株后,经过测定甲醇诱导表达最佳添加条件、重组菌生长量与甲醇添加关系、以及单位产蛋白量、单位产酶量、角质酶最适温度及最适pH等方面数据后,可知此工程菌产酶活高达每100μL12.856U左右,在经过镍柱纯化等步骤后酶活值会更高。在重组菌对桃果实侵染实验后发现,桃褐腐菌角质酶具有较强的侵染力,因此说明重组角质酶工程菌在工业上具有更广阔的应用前景。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章文献综述  12-20
  1.1 角质酶概况  12-14
    1.1.1 角质酶性质  13
    1.1.2 角质酶的存在  13-14
    1.1.3 角质酶在纺织业、食品业、造纸业等行业的应用  14
  1.2 桃褐腐菌角质酶的概况  14-15
  1.3 原核重组表达体系构建及表达策略  15-17
  1.4 真核重组表达体系构建及表达策略  17-18
  1.5 重组菌株酶活分析方法  18-19
  1.6 角质酶侵染力分析原理  19
  1.7 本研究课题的立题背景、研究意义  19-20
第二章桃褐腐菌角质酶基因在原核工程菌中的重组构建与表达  20-47
  2.1 引言  20
  2.2 材料与方法  20-31
    2.2.1 实验材料  20-22
    2.2.2 实验方法  22-31
  2.3 结果与分析  31-45
    2.3.1 重组大肠杆菌pET-28A-cut1/BL21的构建与表达  31-38
    2.3.2 重组克雷伯菌pET-PK-cut1/k.p的构建与两种不同途径的表达  38-45
  2.4 本章小结  45-47
第三章桃褐腐菌角质酶基因在毕赤酵母中重组构建与表达  47-67
  3.1 引言  47-48
  3.2 材料与方法  48-57
    3.2.1 实验材料  48-50
    3.2.2 实验方法  50-57
  3.3 结果与分析  57-66
    3.3.1 重组质粒pPICZαA-cut1的构建  57-60
    3.3.2 重组毕赤酵母pPICZαA-cut1/GS115与表达  60-64
    3.3.3 重组桃褐腐菌角质酶的酶活测定  64-66
  3.4 小结  66-67
第四章重组角质酶侵染桃果实的侵染力分析  67-74
  4.1 引言  67
  4.2 材料与方法  67-68
    4.2.1 实验材料  67
    4.2.2 实验方法  67-68
  4.3 侵染结果分析  68-73
  4.4 小结  73-74
第五章结论与展望  74-76
  5.1 结论  74-75
  5.2 展望  75-76
致谢  76-77
研究成果及发表的学术论文  77-78
作者简介  78-79
参考文献  79-82
硕士研究生学位谂文答辩委员会决议书  82-83

桃褐腐菌角质酶的克隆与表达

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