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灰葡萄孢角质酶的致病作用及角质酶突变菌株的基因分析

作　者: 孙媛
导　师: 童蕴慧
学　校: 扬州大学
专　业: 植物病理学
关键词: 灰葡萄孢角质酶致病作用基因克隆实时荧光定量PCR
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)是重要的植物病原真菌,其产生的降解酶类是主要的致病因子。角质酶是病菌产生的能够降解植物体表角质层的水解酶。明确角质酶的致病作用,能够为进一步解析病菌致病机理提供依据。用紫外线诱变灰葡萄孢H2菌株,得到两株产角质酶能力增强的突变菌株H2-M1、H2-M2,其菌丝分泌的酶活性分别达34.68U/mL,33.51U/mL,分别为出发菌株的2.05倍和1.98倍；两株产酶能力降低的菌株H2-M3,H2-M4,酶活性为3.80U/mL,3.98U/mL,分别占出发菌株的22.5%与23.5%。出发菌株菌丝产生的角质酶活性为16.92U/mL。病菌萌发过程中芽管也能分泌角质酶,与菌丝相比酶活性较低。H2-M1、H2-M2、H2-M3和H2-M4分生孢子萌发时的角质酶活性分别为0.20U/mL、0.18U/mL、0.01U/mL和0.01U/mL,出发菌株酶活性为0.10U/mL对突变菌株致病因子检测结果表明,4株突变菌株除产角质酶的性状发生了变异外,其它致病因子(果胶酶、纤维素酶、毒素)的代谢与出发菌株均没有显著差异。利用上述5个菌株的分生孢子悬浮液对番茄叶片喷雾接种,菌饼对果实接种,检测其致病性。结果表明,产酶能力强的两个突变菌株H2-M1、H2-M2,其致病力明显高于出发菌株,而酶活性低的H2-M3、H2-M4则显著低于出发菌株。对草莓果实和叶片的致病力检测结果与对番茄的检测结果一致,产生角质酶较少的突变株,其致病力显著低于出发菌株。从以上试验内容可以看出,灰葡萄孢角质酶在病菌侵入过程中能起促进病菌侵入、增加病菌毒力的作用。通过PCR技术,克隆获得突变菌株的角质酶基因,与出发菌株比较,虽然有少数碱基的差异,但是突变位点不在酶活性中心部位,也不在与底物结合部位；内含子中也有少数位点碱基发生变化,但编码的蛋白质与出发菌株一样。因此突变菌株的角质酶基因与出发菌株相比基本一致。实时荧光定量PCR (Real-time qPCR)研究表明,角质酶基因在突变菌株中都能表达,但是H2-M1和H2-M2表达量高于出发菌株2倍以上,而H2-M3和H2-M4的表达量显著低于出发菌株,分别只有出发菌株的21%和19%。因此突变菌株的角质酶基因并未发生变异,产酶性状的变异可能是由基因转录改变造成的。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-24
  一、真菌角质酶研究  9-20
    (一) 角质酶性质  9-11
    (二) 角质酶催化机理  11-12
    (三) 角质酶基因研究  12-13
    (四) 角质酶在病菌致病过程中的作用  13-18
    (五) 角质酶应用  18-20
  二、灰葡萄孢及其角质酶  20-23
    (一) 灰葡萄孢病害及其危害性  20
    (二) 灰葡萄孢生物学特征  20-21
    (三) 灰葡萄孢的致病性  21-22
    (四) 灰葡萄孢角质酶的研究  22-23
  三、本论文研究目的与意义  23-24
材料与方法  24-37
  一、供试植株  24
  二、试验菌株  24
  三、培养基及培养液  24-25
    (一) 真菌培养基  24
    (二) 改良的查彼克——多克斯矿质培养基  24
    (三) 灰葡萄孢产酶培养液及产毒素培养液  24-25
    (四) LB培养基  25
  四、试剂和仪器  25-27
    (一) 主要试剂  25-27
    (二) 主要仪器  27
  五、角质酶突变体诱变与筛选  27-28
    (一) 诱变方法  27
    (二) 筛选方法  27-28
  六、突变体致病因子测定  28-31
    (一) 角质酶测定  28-29
    (二) 胞壁降解酶测定  29-31
    (三) 毒素测定  31
  七、灰葡萄孢基因组DNA提取  31-32
    (一) DNA提取  32
    (二) DNA纯度和浓度测定  32
  八、角质酶基因克隆  32-34
    (一) 引物设计  32
    (二) PCR扩增  32-33
    (三) PCR产物纯化  33
    (四) 重组质粒构建  33-34
    (五) 重组质粒DNA提取  34
  九、灰葡萄孢角质酶基因的表达  34-35
    (一) 灰葡萄孢RNA的提取  34
    (二) 反转录  34-35
    (三) 实时荧光定量PCR检测  35
  十、病菌致病力测定方法  35-37
    (一) 接种方法  36
    (二) 严重度分级标准  36-37
结果与分析  37-54
  一、角质酶突变菌株筛选  37
  二、突变菌株角质酶活性  37-40
    (一) 分生孢子产生的角质酶  37-38
    (二) 菌丝产生的角质酶  38-39
    (三) 产酶性状的稳定性  39-40
  三、突变菌株生物学特性  40-41
    (一) 菌丝生长及菌落特征  40-41
    (二) 胞壁降解酶与毒素活性  41
  四、突变菌株的致病作用  41-44
  五、角质酶基因克隆和序列分析  44-48
    (一) 基因组DNA提取  44-45
    (二) 角质酶基因克隆  45-46
    (三) 角质酶基因序列比对  46-48
  六、突变菌株角质酶基因的表达量  48-54
    (一) 灰葡萄孢RNA提取  48-49
    (二) 实时荧光定量PCR检测  49-54
讨论  54-57
  一、角质酶的致病作用  54
  二、角质酶基因  54-56
  三、实时荧光定量PCR  56-57
参考文献  57-66
附录  66-70
致谢  70-71

灰葡萄孢角质酶的致病作用及角质酶突变菌株的基因分析

内容摘要

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