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鲫鱼gherlin基因cDNA序列基因的克隆与原核表达研究

作　者: 周朝伟
导　师: 李志琼
学　校: 四川农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 鲫鱼 ghrelin基因克隆原核表达
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本试验根据GenBank登录的金鱼(AF454389)、鲤鱼(AB332394)、斑点叉尾鮰(AB196449)和斑马鱼(EU908736)的ghrelin基因序列的同源性和保守区设计并合成了特异性引物,利用RT-PCR方法从鲫鱼肠道总RNA中扩增出为490bp的目的片段。将目的基因克隆到pMD19-T载体上,序列测定结果表明与ghrelin基因ORF区完全一致。序列分析表明：获得了长490 bp的ghrelin蛋白基因(GenBank登录号HM567312),其序列含1个312 bp的完整开放阅读框,编码103个氨基酸；ghrelin蛋白理论相对分子质量为11519.48道尔顿,等电点为5.20,半衰期为1.20h,不稳定系数为31.29,总平均亲水性为0.727,疏水性介于-2.900～2.856；在1～26位氨基酸可能是信号肽序列；在ghrelin分子序列中存在44处α螺旋富集区域,8处β折叠区域,集中于成熟肽部分,有43处无规则卷曲。系统进化树分析显示鲫鱼ghrelin基因与金鱼进化距离最近,高达99.0%。利用荧光定量技术发现：鲫鱼ghrelin基因在肠道、肝脏和中肾的表达量高,并且肠道的表达量最高；鲫鱼ghrelin基因在头肾、脑垂体、肌肉和脾脏中的表达量一般；在皮肤、心脏和鳃中没有检测到ghrelin基因mRNA的表达。利用primer5.0软件,分别在ORF上下游设计一对分别带限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的上、下游特异引物,采用PCR技术,以鲫鱼ghrelin基因克隆载体为模板,扩增出成熟蛋白的编码基因(248 bp),并将其插入pET-32a(+)表达质粒,构建了鲫鱼ghrelin成熟蛋白原核表达质粒。阳性重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序验证后转化大肠杆菌Rosetta (DE3),经IPTG诱导,重组蛋白成功表达,表达蛋白的分子量约27.0KD,诱导温度为37℃,重组蛋白以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在。试验确定鲫鱼ghrelin重组成熟蛋白表达的最佳条件为IPTG 0.3 mmol/L,37℃诱导培养4 h,鲫鱼ghrelin重组成熟蛋白表达的相对含量达到42.6%。本试验首次克隆鲫鱼ghrelin基因,并通过对基因序列改造后经原核表达出鲫鱼ghrelin融合蛋白,这为进一步研究鲫鱼ghrelin在体内外的作用,并为研究其生理活性的作用提供了条件。

全文目录

中文摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
第一章文献综述  10-21
  1 GHRELIN的分布  11-13
  2 GHRELIN的生理功能  13-17
    2.1 调节垂体激素的分泌  13-15
    2.2 调节摄食  15-17
    2.3 调节繁殖  17
  3 鱼类GHRELIN的氨基酸组成与序列分析  17-18
  4 GHRELIN基因的分离、克隆和表达  18-20
  5 试验目的及意义  20-21
第二章鲫鱼GHRELIN基因的克隆  21-36
  1 材料  22-24
    1.1 试验动物  22
    1.2 菌株和载体  22
    1.3 主要试剂  22
    1.4 溶液配制  22-23
    1.5 主要仪器设备  23-24
  2 方法  24-29
    2.1 肠道的分离和总RNA的提取  24
    2.2 ghrelin基因的克隆  24-29
    2.3 ghrelin基因生物信息学分析  29
    2.4 ghrelin基因的系统进化树分析  29
  3 结果  29-34
    3.1 肠道总RNA  29
    3.2 ghrelin基因的克隆  29-30
    3.3 重组质粒PCR鉴定  30
    3.4 序列测定  30
    3.5 ghrelin基因生物信息学分析  30-34
    3.6 系统进化树分析  34
  4 分析和讨论  34-35
  5 小结  35-36
第三章鲫鱼GHRELIN基因在不同组织表达量  36-41
  1 材料  36
    1.1 实验动物  36
    1.2 主要试剂  36
  2 方法  36-38
    2.1 引物设计  36-37
    2.2 荧光定量  37-38
  3 结果  38-39
    3.1 扩增产物的特异性  38-39
    3.2 ghrelin基因的组织表达  39
  4 讨论  39-41
    4.1 荧光定量结果的数据处理  39-40
    4.2 ghrelin基因在组织中的表达  40-41
第四章鲫鱼GHRELIN基因成熟蛋白的原核表达  41-53
  1 材料  41-43
    1.1 菌株和质粒  41
    1.2 主要试剂  41
    1.3 溶液配制  41-43
  2 方法  43-46
    2.1 ghrelin基因的亚克隆  43
    2.2 表达载体质粒的获得和处理  43-44
    2.3 目的基因和表达载体的双酶切  44
    2.4 成熟蛋白基因重组表达质粒的构建  44
    2.5 成熟蛋白基因重组表达质粒的诱导表达  44-46
  3 结果  46-50
    3.1 ghrelin基因的亚克隆  46
    3.2 酶切鉴定  46-47
    3.3 重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定  47-48
    3.4 原核表达条件的优化  48-49
    3.5 诱导表达和可溶性检测  49-50
  4 讨论  50-52
    4.1 鲫鱼ghrelin重组成熟蛋白表达载体的选择  50-51
    4.2 鲫鱼ghrelin重组成熟蛋白表达条件的优化  51
    4.3 鲫鱼ghrelin重组成熟蛋白可溶性鉴定  51-52
  5 小结  52-53
参考文献  53-56
致谢  56-57
附录  57

鲫鱼gherlin基因cDNA序列基因的克隆与原核表达研究

内容摘要

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